敲減TLR2基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制

孟 爽，李迎杰，臧曉珍，趙乾芳，張 進(jìn)， 李 靜

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 錦州121000)

結(jié)直腸癌是目前全球最常見的惡性腫瘤之一，是世界上第4位癌癥死亡原因，到2030年，全球預(yù)計(jì)將有220萬新發(fā)病例和110萬死亡病例，嚴(yán)重威脅人類的健康，尋求分子靶點(diǎn)將成為結(jié)直腸癌治療新的突破點(diǎn)[1-3]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一系列先天免疫傳感器，不僅是形成先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，而且還可以激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng),廣泛涉及傳染性、炎癥性和過敏性疾病以及致癌作用，其中Toll樣受體2(Toll-like receptor-2,TLR2)分布表達(dá)于很多腫瘤細(xì)胞和組織中[4-8]。研究[6]表明:靶向敲減TLR2基因的表達(dá)能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。有研究[9]顯示:結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中TLR2高表達(dá)，TLR2在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。然而TLR2基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞增殖作用的相關(guān)研究較少，且其作用機(jī)制仍然有待進(jìn)一步闡明。抑制TLR2表達(dá)對(duì)抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展也可能有重要的臨床指導(dǎo)意義。慢病毒RNA干擾技術(shù)是進(jìn)行靶基因表達(dá)抑制的核酸操作技術(shù)，目前已成為研究腫瘤基因治療的重要工具。本研究采用慢病毒RNA干擾技術(shù)，敲減TLR2基因在結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞中的表達(dá)，觀察其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響，并對(duì)其相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行探討，以期為結(jié)直腸癌抗癌治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。McCoy’s 5A 培養(yǎng)液及胎牛血清(美國Gibco公司)， 慢病毒及轉(zhuǎn)染試劑(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司)， CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)， 細(xì)胞周期試劑盒(上海貝博生物公司)， 單克隆抗體TLR2、 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B (p-Akt)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)和細(xì)胞周期蛋白D3(cyclin D3)(美國Cell Signaling Technology公司)， 電化學(xué)發(fā)光試劑(美國Azure Biosystems公司)。倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，NovoCyte流式細(xì)胞儀(杭州艾森生物有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞在McCoy’s 5A培養(yǎng)基中生長，補(bǔ)充10%胎牛血清及1%青鏈霉素。在含5%CO2、濕潤無菌的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將對(duì)數(shù)生長的細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后鋪板過夜, 更換感染培養(yǎng)基, 細(xì)胞分為未感染對(duì)照組、陰性對(duì)照組和基因敲減組(TLR2-RNAi組)。根據(jù)感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為30加入最適量慢病毒及4%轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行感染, 未感染對(duì)照組不做任何處理，陰性對(duì)照組感染陰性對(duì)照iRNA,TLR2-RNAi組感染TLR2-RNAi；約12～16 h, 更換為用常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好、 細(xì)胞感染效率達(dá)到80%以上時(shí), 加入1 mg·L-1嘌呤霉素進(jìn)一步篩選感染慢病毒的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d后進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染效率=熒光陽性細(xì)胞數(shù)/篩選細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 蛋白印跡法檢測(cè)TLR2蛋白的表達(dá)收集各組細(xì)胞后，采用含PMSF的裂解液在冰上裂解30 min，在4℃、12 000 r·min-1離心30 min，然后采用BCA法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，制備總蛋白量相同的蛋白質(zhì)樣品。采用10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；在室溫下采用5%脫脂牛奶封閉2 h，將一抗(TLR2和GAPDH)以1∶1 000稀釋后，于4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5 min后，用二抗1∶5 000在室溫下孵育2 h；TBST洗膜3次，每次5 min后通過ECL發(fā)光液使膜條帶可視化，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。以各實(shí)驗(yàn)組蛋白灰度值與相應(yīng)內(nèi)參灰度值的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性將上述各組HCT116細(xì)胞(每孔2 000個(gè)細(xì)胞)和HT29細(xì)胞(每孔5 000個(gè)細(xì)胞)接種于96孔培養(yǎng)板,每組設(shè)置5個(gè)平行孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別于細(xì)胞貼壁0、24、48和72 h后加入90 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8溶液，同時(shí)設(shè)置只含有培養(yǎng)基和CCK-8溶液的空白對(duì)照孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h,于 酶標(biāo)儀450 nm波長處測(cè)定各組吸光度(A) 值，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，繪制生長曲線，計(jì)算細(xì)胞增殖活性。細(xì)胞增殖活性=實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率將各組細(xì)胞以每孔5×105個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞；用預(yù)冷PBS緩沖液沖洗2次，300 μL預(yù)冷PBS緩沖液重懸后，用700 μL預(yù)冷的無水乙醇緩慢滴注并混勻，4℃固定過夜，1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，預(yù)冷PBS緩沖液沖洗2次；500 μL預(yù)冷PBS緩沖液重懸細(xì)胞后加入Rnase A溶液20 μL ，37℃水浴30 min，1 000 r·min-1離心5 min后棄上清；加入500 μL PI染色液重懸細(xì)胞，4℃避光染色30 min，采用流式細(xì)胞儀以標(biāo)準(zhǔn)程序檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。NovoExpress 1.1.0軟件進(jìn)行細(xì)胞周期DNA含量分析，計(jì)算不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率。

1.6 蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞中信號(hào)通路及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平將各組細(xì)胞的蛋白質(zhì)樣品采用10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；在室溫下采用5%脫脂牛奶封閉2 h；根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行切膜，在第一板膠轉(zhuǎn)印后的PVDF膜上切出PI3K、cyclin D1和β-tubulin所在條帶，另一板膠轉(zhuǎn)印后的PVDF膜上切出p-Akt、cyclin D3和β-actin所在條帶，第三板膠轉(zhuǎn)印后的PVDF膜上切出p-NF-κB和β-actin所在條帶，分別將相對(duì)應(yīng)的一抗以1∶1 000稀釋后，于4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5 min，采用二抗1∶5 000在室溫下孵育2 h；TBST洗膜3次，每次5 min，通過ECL發(fā)光液使膜條帶可視化，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。以各實(shí)驗(yàn)組蛋白灰度值與相應(yīng)內(nèi)參灰度值的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率在構(gòu)建慢病毒感染的穩(wěn)轉(zhuǎn)株過程中，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示：陰性對(duì)照組和TLR2-RNAi組HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到80%以上，轉(zhuǎn)染效率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可進(jìn)行TLR2蛋白表達(dá)的驗(yàn)證。見圖1、圖2 和表1。

A-C: White photos; D-F: Fluorescence photos; A,D: Non-infection control group; B,E: Negative control group; C,F: TLR2-RNAi group.

Fig.1 Transfection efficiencies of HCT116 cells at 5 d after infection of lentivirus under fluorescence microscope (×50)

2.2 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞中TLR2蛋白表達(dá)水平蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示：未感染對(duì)照組、陰性對(duì)照組和TLR2-RNAi組HCT116細(xì)胞中TLR2蛋白表達(dá)水平分別為0.98±0.06、0.94±0.03和0.33±0.09；HT29細(xì)胞中TLR2蛋白表達(dá)水平分別為1.01±0.06、0.96±0.12和0.52±0.03。與未感染對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，TLR2-RNAi組HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞中TLR2蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)。見圖 3。

A-C: White photos; D-F: Fluorescence photos; A,D: Non-infection control group; B,E: Negative control group; C,F: TLR2-RNAi group.

Fig.2 Transfection efficiencies of HT29 cells at 5 d after infection of lentivirus under fluorescence microscope (×50)

表1 各組HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

GroupTransfection efficiency of HCT116 cells Transfection efficiency of HT29 cells Non-infection control0.00±0.000.00±0.00Negative control86.33±4.5488.33±2.25TLR2-RNAi86.50±2.7887.17±2.52

2.3 各組細(xì)胞增殖活性CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示：在感染24、48和72 h時(shí)，與未感染對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，TLR2-RNAi組HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞增殖活性明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.4 各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率與未感染對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，TLR2-RNAi組HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞中S期細(xì)胞百分率明顯降低(P<0.05)，HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞中G1期細(xì)胞百分率明顯升高(P<0.05)。見圖4和表3。

Lane 1: Non-infection control group; Lane 2: Negative control group; Lane 3: TLR2-RNAi group.

圖3 蛋白印跡法檢測(cè)各組HCT116(A)細(xì)胞和HT29(B)細(xì)胞中TLR2蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of expressions of TLR2 protein in HCT116 cells(A)and HT29 cells(B)in various groups detected by Western blotting method

表2 CCK-8法檢測(cè)各組HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞增殖活性

GroupProliferation activity of HCT116 cells (t/h) 0244872Non-infection control0.191±0.0090.547±0.0150.785±0.0251.153±0.032Negative control0.194±0.0100.532±0.0090.800±0.0311.134±0.051TLR2-RNAi0.185±0.0050.373±0.033?△0.529±0.023?△0.763±0.041?△Group Proliferation activity of HT29 cells (t/h) 0244872Non-infection control0.320±0.0100.486±0.0150.675±0.0190.883±0.016Negative control0.308±0.0090.478±0.0210.670±0.0210.924±0.022TLR2-RNAi0.313±0.0140.393±0.014?△0.535±0.016?△0.762±0.020?△

*P<0.05 compared with non-infection control group;△P<0.05 compared with negative control group.

2.5 各組細(xì)胞中細(xì)胞信號(hào)通路和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)與未感染對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，TLR2-RNAi組HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞中PI3K、p-Akt、p-NF-κB、cyclin D1和cyclin D3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見圖 5和表4。

A,D: Non-infection control group; B,E: Negative control group; C,F: TLR2-RNAi group.

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞百分率

GroupPercentage of HCT116 cellsG1SG2Percentage of HT29 cellsG1SG2Non-infection control19.54±2.5157.86±3.9021.24±4.1248.08±3.0348.67±4.493.07±1.91Negative control18.40±3.5157.27±6.3722.65±9.6846.21±4.7449.64±3.163.58±1.94TLR2-RNAi47.52±5.18?△33.92±3.60?△17.33±7.4458.28±2.31?△38.40±1.35?△3.28±2.11

*P<0.05 compared with non-infection control group;△P<0.05 compared with negative control group.

Lane 1: Non-infection control group; Lane 2: Negative control group; Lane 3: TLR2-RNAi group.

圖5 蛋白印跡法檢測(cè)各組HCT116細(xì)胞(A)和HT29細(xì)胞(B)中細(xì)胞信號(hào)通路和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.5 Electrophoregram of expressions of cell signaling pathway-related proteins and cell cycle-related proteins in HCT116 cells(A)and HT29 cells(B)in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

研究[10]顯示：在大多數(shù)胃癌患者中TLR2蛋白呈高水平表達(dá)，且TLR2蛋白高水平表達(dá)與增殖基因相關(guān)并提示預(yù)后不良，也有研究[11]提示TLR2促進(jìn)胃癌的發(fā)生；TLR2在胰腺癌、套細(xì)胞淋巴瘤和乳腺癌中也有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用[12-14]；研究[5-6，9，15-19]表明：結(jié)直腸癌組織通常比來自同一患者的正常結(jié)腸黏膜具有更高的TLR2基因表達(dá)水平，且在結(jié)直腸癌中TLR2基因和TLR4基因的激活也表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染敲減結(jié)直腸癌細(xì)胞中的TLR2基因，在第24、48和72小時(shí)與未感染對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TLR2-RNAi組細(xì)胞增殖活性明顯降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果提示：敲減TLR2基因表達(dá)能夠明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。本研究中細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示：與未感染對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，TLR2-RNAi組HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞中G1期細(xì)胞百分率明顯升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示敲減TLR2基因表達(dá)能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯在G1期，從而明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞周期。上述結(jié)果進(jìn)一步說明敲減TLR2基因可能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖作用。

表4 蛋白印跡法檢測(cè)各組HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞中細(xì)胞信號(hào)通路和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平

GroupExpression level of protein in HCT116 cellsPI3Kp-Aktp-NF-κBCyclin D1Cyclin D3Non-infection control1.05±0.111.23±0.051.06±0.100.89±0.021.19±0.12Negative control0.88±0.111.25±0.241.02±0.240.84±0.071.15±0.19TLR2-RNAi0.41±0.03?△0.49±0.17?△0.29±0.15?△0.35±0.08?△0.57±0.10?△GroupExpression level of protein in HT29 cellsPI3Kp-Aktp-NF-κBCyclin D1Cyclin D3Non-infection control1.16±0.071.19±0.131.07±0.141.03±0.091.19±0.05Negative control1.05±0.181.03±0.120.90±0.120.87±0.101.06±0.09TLR2-RNAi0.59±0.08?△0.50±0.14?△0.55±0.11?△0.44±0.10?△0.53±0.13?△

*P<0.01 compared with non-infection control group;△P<0.01 compared with negative control group.

包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的各種腫瘤發(fā)病機(jī)制均是多元化的，并且通過多條細(xì)胞信號(hào)通路的協(xié)同調(diào)控。PI3K/Akt信號(hào)通路參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，NF-κB信號(hào)通路是重要的炎癥信號(hào)通路[5]。cyclin D1和cyclin D3是位于PI3K/Akt和NF-κB信號(hào)通路的下游蛋白,NF-κB屬于Rel家族的轉(zhuǎn)錄因子，其參與免疫和炎癥反應(yīng)，NF-κB的p65亞基是cyclin D1基因的有效轉(zhuǎn)錄激活因子，是cyclin D1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄激活所必需[14,19]。在細(xì)胞增殖進(jìn)程中cyclins起正性調(diào)節(jié)作用。cyclin D1與cyclin D3的主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖，通過結(jié)合并激活 G1期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，G1期周期抑制蛋白(Rb)被磷酸化，磷酸化的Rb蛋白從其所結(jié)合的E2F轉(zhuǎn)錄因子上解離，從而釋放出E2F轉(zhuǎn)錄因子，E2F與相應(yīng)的含有E2F調(diào)節(jié)元件的DNA結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而推動(dòng)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入到S期[20-21]。本研究結(jié)果顯示：與未感染對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，TLR2-RNAi組HCT116和HT29細(xì)胞中PI3K、p-Akt、p-NF-κB、cyclin D1和cyclin D3蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果表明敲減TLR2基因可能通過調(diào)控PI3K/Akt和NF-κB細(xì)胞信號(hào)通路及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1和cyclin D3的表達(dá)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，敲減TLR2基因可以通過調(diào)控PI3K/Akt和NF-κB細(xì)胞信號(hào)通路及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1和 cyclin D3的表達(dá)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。本研究證明了TLR2在結(jié)直腸癌中可能起著關(guān)鍵性的作用，并且可能為結(jié)直腸癌的抗癌治療提供新的靶點(diǎn)。