肌肽對血管性認知障礙大鼠氧化應激及NF-κB信號途徑的影響

楊文強，何 鑫，白 雪，于 露，李宗澤，張家悅，楊 菁

(錦州醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，遼寧 錦州 121001)

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是由于腦出血、腦缺血和腦區低灌注等腦血管病引起腦組織血液供應障礙導致腦功能減退而出現的學習記憶能力下降和嚴重認知功能障礙[1]。VD是第2位常見的認知功能障礙，是由血管性認知障礙(vascular cognitive impairment, VCI)發展而來[1-2]。研究VCI的發病機制，找出早期防治的有效方法，具有重要的臨床意義和社會價值。VCI的發生發展是一個復雜的過程，包括諸多環節，其中氧自由基的累積和炎癥反應等發揮重要的作用[2]。

肌肽是一種由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的水溶性二肽。研究[3-4]表明:肌肽對低氧所致大鼠內皮細胞及腦片損傷具有保護作用，其機制可能與其改善腦組織能量代謝，增強抗氧化能力有關。肌肽還具有抗炎及穩定細胞內pH值等作用。但肌肽對VCI的影響卻鮮有報道。本研究以雙側頸總動脈夾閉再灌注配合腹腔注射硝普鈉減壓法建立VCI大鼠模型，觀察肌肽對VCI大鼠學習記憶能力的影響，探討肌肽對VCI大鼠的保護作用及其機制，為肌肽的利用提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器健康雄性SD大鼠50只，體質量250～280 g，由錦州醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號： SCXK(遼) 2017-0004。肌肽(純度>99.0%，批號：1703061，由蘇州富士萊醫藥股份公司惠贈)。膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)(sc-58766，盛克魯斯生物技術有限公司)，磷酸化核因子-κB p56(phosphate nuclear factor-kappaB p65,p-NF-κB p65)抗體(貨號AB11014，美國ABsci公司)，β-actin、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、ECL化學發光顯色試劑盒和BCA試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)，哺乳動物組織總蛋白抽提試劑(貨號AR0101-100，武漢博士德生物工程有限公司)，SP-9000檢測試劑盒、ZLI-9018和DAB顯色試劑盒(20×)(北京中杉金橋生物技術有限公司)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒(上海通蔚實業有限公司)。Morris 水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所)，LC-10Avp高效液相色譜儀(日本島津公司)。

1.2 實驗動物分組大鼠適應性喂養3 d后，置于Morris水迷宮中學習訓練2 d。于第3天，選擇4次均能在90 s內找到平臺的大鼠為合格實驗動物。合格的50只大鼠，按照隨機原則分為假手術組、模型組和100、300及900 mg·kg-1肌肽組。每組10只，自由覓食飲水，室溫22℃～25℃，每籠2只。肌肽組灌胃給藥。于造模前21 d至造模后12 d，每天8:00～9:00給藥1次，共33 d。手術當日，術前2 h灌胃給藥。假手術組與模型組大鼠給予相同體積生理鹽水。

1.3 VCI模型制備大鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg·kg-1麻醉，仰臥位固定于鼠臺上，常規消毒，頸正中切口，分離雙側頸總動脈，穿線備用。腹腔注射2.5 mg·kg-1硝普鈉造成低血壓，立刻采用無創動脈夾關閉雙側頸總動脈10 min 后, 再通10 min, 再夾閉10 min，造成大腦的缺血再灌注損傷，再通后縫合傷口，放回籠中保溫飼養。假手術組只分離雙側頸總動脈，腹腔不注射硝普鈉，不進行缺血再灌注手術[6]。按上述方法造模后2 h觀察模型大鼠的行為學表現和死亡情況，并對動物進行腦卒中指數評分。評分標準為毛蓬亂豎起、動作緩慢或活動減少、觸耳反應加強、眼瞼下垂，每一項計1分；頭翹起、不閉眼、兩后肢向后向外伸展、轉圈、抽搐或陣攣，每一項計1分；四肢無力或腹部著地計6分。選擇符合腦缺血征象(>10分)并無肢體殘疾和視力受損的大鼠作為合格的實驗動物。300和900 mg·kg-1肌肽組各有1只動物不符合腦缺血征象，予以剔除。實驗過程無動物死亡。

1.4 Morris水迷宮實驗術后第7天開始水迷宮實驗，分為定位航行和空間探索實驗[7]。水迷宮為直徑120 cm、高50 cm的水池，水深30 cm，水溫控制在22.5℃～23.5℃。在水池邊緣等距離標有4個入水點，將水池分為4個象限，直徑9 cm的平臺位于第一象限中央水下1 cm處。每天每只大鼠訓練4次，每次采用不同象限入水點。訓練時將大鼠面朝池壁輕輕放入水池，記錄大鼠尋找平臺所用時間，如果120 s內未找到，則將其放置于平臺上10 s。術后第7天進行定位航行實驗，每天每只大鼠訓練4次，每次采用不同象限入水點。訓練時將大鼠面朝池壁輕輕放入水池，同時啟動記錄裝置，記錄大鼠尋找平臺所用時間，如果120 s內未找到，則將其放置于平臺上10 s，逃避潛伏期記為120 s，4次所用時間均值為大鼠當日潛伏期。連續訓練5 d，后3 d結果為定位航行實驗結果。術后第12天進行空間探索實驗，訓練3次后，撤除平臺，從第二象限將大鼠放入水中，記錄120 s內的游泳軌跡，記錄大鼠在平臺所在象限的時間，為空間探索實驗結果，以檢驗大鼠的記憶能力。水迷宮實驗完成后立即取雙側海馬，一側用于GSH和肌肽含量測定，另一側用于組織學實驗，-80℃凍存。

1.5 免疫組織化學法檢測大鼠海馬組織中GFAP蛋白表達水迷宮實驗后，采用10%水合氯醛350 mg·kg-1麻醉，斷頭后每組迅速選取5個右側海馬置于新配置4%多聚甲醛液中固定。切片常規脫蠟脫水，A液(檸檬酸)18 mL+B液(檸檬酸鈉)82 mL+雙蒸水900 mL于高壓鍋內進行抗原的高壓修復2 min，3%的過氧化氫孵育15 min，滴加GFAP一抗，4℃過夜，生物素化二抗工作液(IgG/Bio)，置于恒溫水浴箱中37℃、30 min，加入辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃、30 min，DAB顯色，蘇木素復染，酒精脫水，二甲苯透明，封片。GFAP陽性表達為棕黃色。

1.6 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測定大鼠海馬組織中肌肽和還原性谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平水迷宮實驗后，采用10%水合氯醛350 mg·kg-1麻醉，斷頭后每組迅速選取海馬組織放于液氮中，轉移到-80℃冰箱保存。檢測于1周內完成。取海馬組織 10～20 mg，加1 mL蒸餾水后，超聲粉碎5個循環，每個循環為10 s，間隔10 s，強度為90%。再加入三氟乙酸10 μL，混勻，4℃、12 000 g離心20 min，分離上清，上清過0.22 μm微孔濾膜，為供試品溶液。利用鄰苯二甲醛衍生法和HPLC外標法測定海馬組織中肌肽水平[8]。

取海馬組織10～20 mg，加入0.3 mL的10 mmol·L-1DTNB磷酸緩沖液，超聲粉碎5個循環，每個循環為10 s，間隔10 s，強度為90%。 4℃、12 000 g離心20 min，取上清后加入等體積無水乙醇，靜置30 min后，上清過0.22 μm微孔濾膜，為供試品溶液。外標法測定海馬組織中還原性GSH水平[9]。

1.7 Western blotting法檢測大鼠海馬組織中p-NF-κB p65蛋白表達水平水迷宮實驗后，采用10%水合氯醛350 mg·kg-1麻醉，斷頭后迅速選取海馬組織放于液氮中，然后轉移到-80℃冰箱保存。稱取濕重約30 mg 的海馬組織，按照組織總蛋白抽提試劑盒操作提取細胞總蛋白。BCA 法對蛋白進行定量。樣品加入Loading Buffer 后煮沸變性5～10 min，再進行電泳和轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，然后一抗4℃孵育過夜和二抗室溫孵育1 h，用ECL 化學發光顯影液，于化學發光凝膠成像系統中顯影成像，采用Image Lab 6.0 軟件進行灰度掃描分析，以β-actin為內參，以各蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示蛋白表達水平。

1.8 大鼠海馬組織中IL-1β和TNF-α水平測定水迷宮實驗后，采用10%水合氯醛350 mg·kg-1麻醉，斷頭后迅速選取海馬組織放于液氮中，然后轉移到-80℃冰箱保存。取約30 mg海馬組織置于9倍的預冷的生理鹽水，制備勻漿，于4℃、3 000 g離心20 min，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書檢測并計算海馬組織中TNF-α和IL-1β水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠水迷宮逃避潛伏期和平臺象限停留時間模型組大鼠逃避潛伏期較假手術組明顯延長(P<0.01)。與模型組比較，不同劑量肌肽組大鼠逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)；且隨著肌肽劑量的增加，逃避潛伏期逐漸縮短。與假手術組比較，模型組大鼠平臺象限停留時間明顯縮短(P<0.01)；與模型組比較，不同劑量肌肽組大鼠平臺象限停留時間明顯延長(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠水迷宮實驗中逃避潛伏期和平臺象限停留時間

GroupDose (mg·kg-1)nEscape latency(t/d) 91011 Time staying in platform quadrant on 12th daySham operation 01027.9±3.922.6±2.114.8±2.053.2±7.1Model 01054.9±4.6?43.9±2.9?35.2±2.5?24.9±2.9?Carnosine1001049.5±4.4△39.7±3.1△30.5±2.7△△28.9±3.4300942.2±3.1△△35.4±4.7△△27.6±4.7△△32.8±3.4△900937.4±3.8△△30.9±2.2△△24.8±2.7△△37.1±3.5△△

*P<0.01 compared with sham operation group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.

2.2 免疫組織化學檢測各組大鼠海馬組織中GFAP蛋白表達GFAP是星形膠質細胞特有的細胞骨架蛋白，在活化的星形膠質細胞中表達明顯增加。假手術組大鼠海馬CA1區可見到少量GFAP陽性表達的星形膠質細胞。與假手術組比較，模型組海馬CA1區GFAP陽性表達的星形膠質細胞數量明顯增多，其形態也稍長，分支稍多;與模型組比較，肌肽組GFAP陽性細胞數量減少，胞體減小、突起細長。同時可見模型組海馬CA1區錐體細胞排列紊亂，部分缺失；肌肽組海馬CA1區錐體細胞排列及數目基本恢復正常。見圖1(插頁四)。

2.3 HPLC法檢測各組大鼠腦海馬組織中肌肽和GSH水平與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織中肌肽水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，不同劑量肌肽組大鼠海馬組織中肌肽水平明顯升高(P<0.01)。與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織中GSH水平明顯降低(P<0.01);與模型組比較，不同劑量肌肽組大鼠海馬組織中GSH水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠腦海馬組織中肌肽和GSH水平

GroupDose(mg·kg-1)Carnosine GSHSham operation 00.39±0.051.68±0.19Model 00.18±0.04?0.22±0.03?Carnosine1000.32±0.04△△0.40±0.03△3000.44±0.04△△0.73±0.09△△9000.55±0.05△△1.42±0.13△△

*P<0.01 compared with sham operation group;△P< 0.05,△△P<0.01 compared with model group.

2.4 Western blotting法檢測各組大鼠海馬組織中p-NF-κB p65蛋白表達水平與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織中p-NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，不同劑量肌肽組大鼠海馬組織中p-NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

2.5 各組大鼠海馬組織中IL-1β和TNF-α水平與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織中IL-1β和TNF-α水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，不同劑量肌肽組大鼠海馬組織中IL-1β和TNF-α水平明顯降低(P<0.01)。見表3。

*P<0.01 compared with sham operation group;△P< 0.05,△△P<0.01 compared with model group.

圖2 Western blotting法檢測各組大鼠海馬組織中p-NF-κB p65蛋白表達電泳圖(A)和直條圖(B)

Fig.2 Electrophoregram(A)and histogram (B) of expressions of p-NF-κB p65 protein in hippocampus tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

表3 各組大鼠海馬組織中IL-1β和TNF-α水平

GroupDose (mg·kg-1)IL-1βTNF-αSham operation 054.4±4.069.9±5.1Model 0121.4±14.1?321.3±24.8?Carnosine10096.2±7.3△235.0±22.6△30082.7±7.5△193.4±17.7△90075.1±5.8△137.2±15.8△

*P<0.01 compared with sham operation group;△P<0.01 compared with model group.

3 討 論

腦缺血再灌注損傷是致VCI的重要原因[10]，本研究采用血管缺血再灌注方法制備大鼠VCI模型，水迷宮實驗結果顯示：模型組大鼠出現明顯的空間學習記憶障礙，表現為大鼠逃避潛伏期明顯延長，平臺象限停留時間明顯減少，表明模型復制成功；與模型組比較，肌肽組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，平臺象限停留時間明顯增加，表明肌肽對缺血再灌引起的認知功能障礙具有保護作用。

海馬與學習記憶密切相關，同時也是腦組織中對缺血最敏感、最易受損的部位之一，其損傷程度與缺血再灌注后認知功能障礙密切相關[11]。本文作者通過對海馬組織的研究來探究肌肽對VCI的保護機制。氧化應激是由機體內產生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)介導的組織和細胞的氧化損傷，在腦缺血再灌損傷中起重要作用[12]。星形膠質細胞能為神經元提供抗氧化的GSH。GSH可清除體內的超氧離子及其他自由基，是大腦中發現的重要的抗氧化劑。本研究結果顯示：模型組大鼠海馬組織中GSH蛋白表達水平明顯下降，說明缺血再灌注損傷可以使星形膠質細胞合成GSH的能力下降或消耗增加；而灌胃給予肌肽可增加海馬組織中肌肽水平，并可增加海馬組織中GSH水平。由于肌肽具有很強的抗氧化能力，因此推測肌肽灌胃可能是通過升高海馬組織中肌肽水平來發揮保護作用的。

NF-κB是一種能調節多種炎癥反應的核轉錄因子。靜息狀態時NF-κB與其抑制蛋白結合成非活性的復合物停留于胞漿。當細胞受到炎癥信號刺激時，抑制蛋白發生降解，隨后NF-κB P65被磷酸化激活并進入胞核內，從而發揮調節基因轉錄表達的功能。本研究結果顯示：與假手術組比較，模型組p-NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高，說明NF-κB途徑被激活；灌胃給予肌肽后p-NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低，說明NF-κB途徑受到抑制。由于ROS 可激活NF-κB[13]，推測肌肽可能是通過增加GSH水平而降低ROS水平來發揮作用的。

星形膠質細胞在中樞神經系統占有重要地位。NF-κB途徑可激活星形膠質細胞，表現為星形膠質細胞胞體肥大，突起增粗、延長，細胞數目增多。GFAP表達水平升高是活化星形膠質細胞增生的主要特征[14-15]。本研究結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠海馬CA1區活化的星形膠質細胞數量明顯增多，突起延長，分支增多；而肌肽組可見增多的活化星形膠質細胞數量明顯降低，形態也接近正常?；罨男切文z質細胞通過提高清除自由基、釋放營養因子等途徑發揮神經保護作用[16]，但過度激活的星形膠質細胞往往會產生大量的炎癥因子對神經有損傷作用[17-18]。

激活的星形膠質細胞可分泌炎性相關因子，如TNF-α和IL-1β等[19-20]。本研究結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織中TNF-α和IL-1β水平明顯升高，而肌肽組海馬組織中TNF-α和IL-1β水平明顯降低。升高的IL-1β和TNF-α可以進一步激活星形膠質細胞，釋放更多的炎癥因子，反過來激活NF-κB途徑，形成惡性循環。敲除NF-κB基因大鼠缺血區神經元受損數量明顯降低，且TNF-α等表達水平均下降[21]，推測肌肽可能通過抑制NF-κB途徑，降低TNF-α和IL-1β的生成來發揮保護作用。

綜上所述，肌肽可以明顯改善缺血再灌注損傷引起的大鼠空間認知功能障礙，其機制可能與其增加大鼠海馬組織中肌肽和GSH水平，提高大鼠的抗氧化能力，抑制NF-κB途徑的異常激活，進而抑制星形膠質細胞的激活，減少炎癥細胞因子IL-1β和TNF-α的釋放有關。