CpG ODN BW006對實驗性牙移動模型大鼠牙周組織中Runx2和Osterix表達的影響及其意義

黃 蕾，劉宇妍，于文雯，周雪純，張 驍，申玉芹，鄭 義，孫新華

(1.吉林大學口腔醫院正畸科，吉林 長春 130021；2.吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室，吉林 長春 130021；3.吉林大學口腔醫院修復科，吉林 長春 130021；4. 吉林大學口腔醫院牙周病科，吉林 長春 130021)

口腔正畸是通過對牙齒施加一定大小的力，引起牙齒移動，解除各種錯頜畸形，改善頜面部功能和美觀的治療方法。臨床上正畸患者可能存在體內激素水平變化或局部牙周組織炎癥，當這些患者的牙齒受到正畸力的作用時，易導致牙周組織改建失衡，出現支抗喪失、牙齒移動過快伴隨牙齒松動度過大等現象。目前研究[1]已明確正畸治療中牙周組織的改建是骨形成和骨吸收兩者偶聯的動態平衡過程，可影響該平衡的因素(物理因素[2]、生物因素[3]和藥物因素[4]等)均可能改變牙齒移動的效率，因此尋找一種安全、穩定且高效的方法來調控牙周組織改建是口腔正畸學領域的研究熱點。免疫刺激性脫氧寡核苷酸(CpG ODN)是一種人工合成的短脫氧核糖核酸單鏈分子。早期研究[5]表明:CpG ODN可通過經典作用方式調控成骨-破骨平衡。研究[6-7]顯示：特定序列的CpG ODN可促進大鼠骨髓間充質干細胞和人牙周膜細胞增殖，且可上調經成骨誘導的骨髓間充質干細胞中Runt-相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)、Osterix和Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)等成骨相關因子的表達，FENG等[8]通過體外研究篩選出CpG ODN BW006具有促進大鼠成骨細胞增殖的作用，但其在體內環境中對牙周組織有何影響未見相關報道。HAN等[9]通過建立大鼠實驗性牙移動模型證實機械刺激可通過上調Runx2和Osterix的表達調控牙周組織改建。基于以上研究，本研究在大鼠實驗性牙移動模型中觀察CpG ODN BW006對牙移動距離、牙周組織中Runx2和Osterix表達的影響，初步探究其對正畸牙移動過程中成骨-破骨平衡的調控作用，為未來深入研究CpG ODN如何調控牙周組織改建奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器7周齡Wistar雄性大鼠36只(吉林大學實驗動物中心提供)，動物合格證號：SCXK(遼)2015-0001，體質量(180±10)g。CpG ODN BW006(5′-TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC-3′)由吉林大學基礎醫學院分子生物學實驗室設計，大連TaKaRa公司合成；磷酸鹽緩沖液(PBS)和蘇木精-伊紅(HE)染色劑(吉林大學口腔醫學院免疫組織化學實驗室配制)；檸檬酸鈉抗原修復液(武漢博士德生物公司)；Runx2抗體和Osterix抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；即用型免疫組織化學超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒和DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)。RM2245石蠟切片機(徠卡公司，德國)，IX71倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.2 實驗動物分組36只Wistar大鼠每籠6只分籠飼養，自由飲水攝食，每12 h晝夜交替，適應性飼養7 d，每只大鼠左側上頜為實驗組(局部注射CpG ODN BW006)，右側上頜為對照組(局部注射PBS)。

1.3 實驗性大鼠牙移動模型的建立大鼠經10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于操作臺，使用高速渦輪機裝配細顆粒金剛砂車針在大鼠上頜切牙唇面和軸角近齦緣處及雙側上頜第一磨牙近中軸角近齦緣處做固位溝，深度約0.25 mm，使用0.25 mm的正畸不銹鋼結扎絲將鎳鈦螺旋拉簧與大鼠上頜第一磨牙和切牙結扎，彈簧測力計調整拉簧力量為0.49 N，以切牙作為支抗牙近中移動雙側第一磨牙(圖1，見插頁四)，每24 h檢查加力裝置，如發生脫落重新結扎。

1.4 給藥途徑和方法大鼠實驗性牙移動模型建立后，于大鼠左側上頜第一磨牙近中頰側牙齦黏膜處局部注射CpG ODN BW006 40 μL，濃度為25 mg·L-1，并于右側同名牙相同部位注射等量PBS溶液，每3 d注射1次，直至實驗結束。

1.5 實驗標本的制備分別于加力3、7和14 d時隨機選取12只大鼠心臟灌流處死，分離含雙側上頜磨牙和牙槽骨的組織塊，置于新配置的4%中性多聚甲醛固定液中常規固定24 h，使用10%乙二胺四乙酸(EDTA)室溫下脫鈣12周，常規梯度脫水，石蠟包埋，沿第一磨牙近遠中方向制備厚度為3～5 μm的連續石蠟切片。分別進行HE染色和免疫組織化學染色。

1.6 HE染色觀察大鼠牙周組織形態表現顯微鏡下選取牙周韌帶完整的切片，常規經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木精染色，鹽酸酒精分化，伊紅復染，脫水、透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察牙周組織形態表現，使用顯微攝像系統(CMS800)進行圖像采集，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量加力7 和14 d時大鼠第一磨牙遠中最凸點與第二磨牙近中最凸點間距離作為牙齒移動距離，單位為mm。

1.7 免疫組織化學染色檢測大鼠牙周組織中Runx2和Osterix陽性表達水平使用Runx2抗體、Osterix抗體、免疫組織化學SP試劑盒和DAB顯色試劑盒進行免疫組織化學染色，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，細胞或組織呈特異性棕黃色染色者為陽性表達信號。染色結果采用顯微攝像系統進行圖像采集，每張切片分別選取陽性表達區域在400倍鏡下采集圖像，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件半定量分析Runx2和Osterix陽性表達區域的平均光密度(average optical density，AOD)值，由同一實驗者重復測量2次后取平均值，即為Runx2和Osterix陽性表達水平。

2 結 果

2.1 2組大鼠牙周組織形態表現壓力側：加力3 d時對照組牙周膜間隙變窄，可見部分牙周韌帶呈玻璃樣變，大量破骨細胞分布于根尖區，尚未見明顯骨吸收；實驗組牙周膜未見明顯變化。加力7 d時對照組可見蠶蝕狀骨吸收陷窩，牙槽骨明顯吸收；實驗組可見破骨細胞活動，出現骨吸收。加力14 d時對照組和實驗組牙周膜纖維基本恢復正常排列，骨吸收活動減弱。張力側：加力3 d時對照組牙周膜間隙增寬，可見牙周膜纖維排列紊亂；實驗組牙周膜間隙未見明顯改變，可見少量成骨細胞。加力7 d時對照組牙周膜間隙進一步增寬，同時可見成骨細胞；實驗組大量成骨細胞沿牙槽骨牙周膜交界處分布。見圖2(插頁五)。加力14 d時對照組牙槽骨豐滿度和高度均低于實驗組。

2.2 2組大鼠牙齒移動距離對照組和實驗組大鼠牙齒移動距離隨時間延長不斷增加；與對照組比較，加力7和14 d時實驗組大鼠牙齒移動距離明顯減少(P<0.01)。見表1和圖3(插頁五)。

表1 不同時間2組大鼠牙齒移動距離

GroupDistance of tooth movement(t/d) 714Control0.585±0.0120.975±0.084Experimental0.347±0.007?0.443±0.016?

*P<0.01 compared with control group.

2.3 2組大鼠牙周組織中Runx2陽性表達水平Runx2主要表達于大鼠牙周膜成纖維細胞、成牙骨質細胞和成骨細胞中，特異性棕黃色染色為陽性表達信號，陰性對照為藍色。加力3 d時實驗組Runx2陽性表達水平高于對照組(P<0.05)；隨著加力時間的延長，實驗組Runx2陽性表達水平升高，7 d時達到峰值，明顯高于對照組(P<0.01);14 d時實驗組Runx2陽性表達水平有所下降，但仍明顯高于對照組(P<0.05)。對照組牙周組織中Runx2陽性表達水平一直較低，3 d時表達水平最高，隨后逐漸下降。見表2和圖4(插頁五)。

表2 2組大鼠牙周組織中Runx2陽性表達水平

GroupExpression level of Runx2 (t/d) 3714Control0.332±0.0230.300±0.2300.295±0.027Experimental0.359±0.026?0.404±0.039??0.326±0.019?

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group.

2.4 2組大鼠牙周組織中Osterix陽性表達水平Osterix主要表達于牙齦成纖維細胞、牙周膜成纖維細胞、成骨細胞及骨細胞中，特異性棕黃色染色為陽性表達信號，陰性對照為藍色。加力3 d時實驗組Osterix陽性表達水平明顯高于對照組(P<0.01)；隨著加力時間的延長，實驗組和對照組Osterix陽性表達水平均呈現先升高后降低的趨勢，7 d時達到峰值，14 d時有所下降，但實驗組Osterix陽性表達水平明顯高于對照組(P<0.01)。見表3和圖5(插頁五)。

表3 2組大鼠牙周組織中Osterix陽性表達水平

GroupExpression level of Osterix (t/d) 3714Control0.262±0.0220.299±0.0170.272±0.017Experimental0.339±0.014?0.349±0.019?0.321±0.014?

*P<0.01 compared with control group.

3 討 論

CpG ODN是長度為20～30個堿基、含有數個CpG基序的脫氧寡核苷酸，CpG基序是以非甲基化CpG為核心，5′端有2個嘌呤、3′端有2個嘧啶的六核苷酸序列，如AACGTT等，CpG基序使ODN具有較強的免疫刺激活性[10]。目前，CpG ODN對成骨細胞增殖分化的作用已經得到驗證，FENG等[8]的研究表明：特定序列的CpG ODN影響成骨細胞相關功能基因的轉錄表達，通過上調MG63細胞中Runx2和Osterix的表達促進成骨細胞增殖活化。CpG ODN BW006是我國自行設計合成的一種線性全硫代修飾B型CpG ODN，對B細胞有很強的免疫刺激活性，由于其本身無免疫原性[11]，不會誘發自身免疫反應，且多項體內研究[12-13]表明其安全性高，局部刺激性小，可通過多種途徑給藥，近年來被廣泛應用于抗腫瘤、抗過敏、抗感染[14]及疫苗佐劑[11]的研究與開發。

正畸牙齒的移動是復雜而精細的生物機械過程，該過程主要依賴于牙周組織對持續性機械力的生物反應[15]，正畸力誘導神經遞質、生長因子和細胞因子生成并通過生物力學信號轉導通路傳遞至破骨細胞和成骨細胞，導致骨吸收和骨形成[16-17]。骨形成的分子機制主要涉及3個階段：增殖、細胞外基質的成熟和礦化。早期骨改建相關研究[8]顯示：CpG ODN BW006可促進大鼠成骨細胞增殖。本實驗通過建立大鼠實驗性牙移動模型，采用局部注射CpG ODN BW006的方法，初步探究其在體內環境下對正畸過程中牙周組織改建的調控作用。本研究結果顯示：與對照組比較，實驗組大鼠牙齒移動距離明顯減小,牙槽骨高度及豐滿度明顯增加，說明CpG ODN BW006抑制了實驗組大鼠的牙槽骨吸收，導致正畸力作用下大鼠第一磨牙的近中移動減慢。為探討其可能的機制，本研究進一步檢測了大鼠牙周組織中Runx2和Osterix蛋白的表達。

Runx2是首個被發現的成骨細胞特異性轉錄因子，通過與啟動子區域的成骨細胞特異順式作用元件2(osteoblast-specifics-acting element 2，OSE2)結合激活一系列標志基因，如骨鈣素(osteocalcin，OCN)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨唾液蛋白(bone sialoprotein，BSP)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)等[18-19]，啟動骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化[20]。早期研究[21]表明：牙周膜中的Runx2是力學信號的靶基因。本研究通過免疫組織化學染色方法檢測了實驗性牙移動模型大鼠牙周組織中Runx2的表達，結果顯示：在正畸力作用下，大鼠牙周組織中Runx2主要表達于牙周膜成纖維細胞、成牙骨質細胞和成骨細胞，加力3 d時局部注射PBS的對照組大鼠牙周組織中Runx2表達水平最高，隨后其表達水平下降，這與QIN等[22]的研究結果一致；局部注射CpG ODN BW006的實驗組大鼠牙周組織中Runx2表達水平則在加力7 d時達到峰值，考慮到有研究表明Runx2在前成骨細胞中表達上調，在未成熟成骨細胞中表達達到最高水平，在成熟的成骨細胞中表達下調，本文作者推測CpG ODN BW006可能使更多的牙周膜干細胞向前成骨細胞分化且促進了前成骨細胞的增殖，一定程度上增加了加力7 d時大鼠牙周組織中未成熟成骨細胞的數量；在14 d實驗期內，實驗組大鼠牙周組織中Runx2表達水平雖先升高后降低，但始終明顯高于對照組，說明CpG ODN BW006可增強大鼠牙移動過程中牙周組織中Runx2的表達水平。

Osterix是2002年由NAKASHIMA等[23]發現的一種鋅指轉錄因子，研究[24-25]表明：Osterix是成骨細胞生成、分化和骨組織發育重要的調控因子，通過激活一系列基因在前成骨細胞分化為成熟成骨細胞和骨細胞的過程中起重要作用。本研究結果顯示：機械刺激使大鼠牙周組織中Osterix的表達水平先升高后降低，加力7 d時達到最高值，該結果與HAN等[9]的動物實驗研究結果相符。本研究中與對照組比較，實驗組大鼠牙周組織中Osterix陽性表達水平明顯升高，進一步說明局部注射CpG ODN BW006也可上調牙移動過程中大鼠牙周組織中Osterix的表達。牙槽骨中成骨細胞的分化成熟是一個多步驟的復雜過程，牙周膜干細胞形成前成骨細胞的關鍵因子是Runx2，而Osterix是前成骨細胞分化為成熟成骨細胞的關鍵因子，且Osterix是 Runx2 的下游信號分子，受Runx2的調控[18]，在本研究中大鼠牙周組織中Runx2和Osterix陽性表達水平的變化證明其符合生物調控的規律。

CpG ODN BW006的安全性是體內用藥所必須考慮的。本研究中大鼠局部注射部位未觀察到明顯的黏膜變化，如水腫、發紅或糜爛等，結合已有關于CpG ODN BW006安全性的研究[13]，提示大鼠注射該劑量CpG ODN BW006處于安全范圍之內，但關于其局部注射的生物安全性尚待進一步驗證。

本研究通過建立大鼠實驗性牙移動模型，證實了CpG ODN BW006可減少正畸力作用下大鼠牙齒的移動距離，初步闡明其可能途徑是通過上調牙周組織中Runx2和Osterix的表達水平來調控牙周組織改建，但具體作用機制尚有待今后深入研究。本研究為深入探討CpG ODN調控牙周組織改建奠定了體內實驗基礎，局部注射CpG ODN BW006有望成為調控牙周組織改建的新途徑。