miR-3685 通過靶向CTTN 抑制宮頸癌細胞的遷移、侵襲及生長

閆曉芳，謝 虹，湯 華

（天津醫科大學基礎醫學院病原生物學系，天津市生命科學中心實驗室，天津市炎癥生物學重點實驗室，天津300070）

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，在全世界可以導致死亡的癌癥中排名第四位[1]。研究表明，每年有超過50 萬名女性被診斷患有宮頸癌，每年因患有宮頸癌而死亡的人數超過30 萬[2]。所以研究用于宮頸癌早期診斷或預后的新型生物標志物對于女性健康是必須的。miRNA 是短鏈單鏈非編碼RNA，參與各種生理和病理過程[3]。大量研究表明miRNA 在包括癌癥在內的多種疾病中發揮著不同的作用[4-5]，它們可能以一種致癌基因的身份去參與調節細胞的增殖能力、凋亡速率、侵襲性及轉移[6]。例如，miR-148a 作為腫瘤抑制基因通過直接靶定Wnt1 mRNA 的3′UTR 抑制肺癌細胞的遷移和侵襲[7]，miR-221-3p 可以通過靶向THBS2 來治療癌癥[8]，本實驗室報道了一種新的miRNA（miR-G-1）通過靶向TMED5 促進宮頸癌細胞的惡性行為和核自噬[9]。但是，目前miR-3685 對宮頸癌細胞的功能研究知之甚少，作用機制也尚不清楚。CTTN 基因位于人染色體11q13，有研究證明其能夠促進食管癌細胞系的運動、侵襲以及抗失巢凋亡能力[10]。比起正常組織，在26%的乳腺癌組織中可以觀察到CTTN 含量增多，并且CTTN 的過表達可以促進多種癌細胞的運動性和侵襲性[11-12]，但是CTTN 對宮頸癌細胞的功能作用尚不清楚。所以，本文旨在探討miR-3685 和CTTN 對宮頸癌細胞惡性行為的影響，從而為宮頸癌提供新的治療思路。

綜上所述，本實驗結果首次證明了miR-3685通過抑制宮頸癌細胞遷移、侵襲和生長來抑制其惡性行為，本研究強調了miR-3685-CTTN 軸在宮頸癌發病機制中的重要性，該調控軸可以為預防宮頸癌的發生提供潛在的價值和治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 宮頸癌HeLa和SiHa細胞（美國ATCC公司），RPMI1640 液體培養基、DMEM 液體培養基（美國GIBCO 公司），細胞上皮標志物E-cadherin抗體、細胞間質標志物vimentin 抗體、EGFP 抗體、偶聯HRP 的山羊抗兔抗體（天津賽爾生物公司），細胞培養箱（美國Thermo Fisher 公司），胎牛血清（FBS；美國Hyclon 公司），LipofectamineTM 2000 regent（美國Invitrogen 公司），Matrigel、流式細胞儀（美國BD Biosciences 公司），RNase A（100U；德國Calbiochem 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養人宮頸癌細胞系 HeLa 和SiHa 細胞在含有8%或10%胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素和100 IU/mL 青霉素的RPMI-1640 或DMEM 培養基中培養，將細胞孵育在37 ℃，5%CO2的培養箱中，2～3 d 更換1 次新鮮培養液，待細胞匯合度達到80%～90%時進行傳代培養。

1.2.2 細胞轉染 提前1 d 接種指數生長的HeLa細胞和SiHa 細胞于24 孔細胞培養板，使細胞匯合度在培養14～18 h 時達到70%～80%。配制A 轉染液：在100 μL 液體培養基（Opti-MEMα）中加入1 μg 實驗組質粒或者對照組質粒，吹吸混勻。配制B轉染液：把1 μL Lipofectamine 2000 Reagent 脂質體加在100 μL 液體Opti-MEMα 中混勻，5 min 后，將A、B 液混合，20 min 后，將混合液加入到24 孔細胞培養板，4～6 h 棄掉培養板中的液體，每孔加入1 mL含血清的液體培養基，在培養箱中繼續孵育。

1.2.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR） 使用SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，大連，中國）進行RTqPCR 以檢測miRNA 和mRNA 的表達水平。小RNA特異性莖環逆轉錄引物用于進行miRNA 的逆轉錄。U6 snRNA 和β-肌動蛋白分別用作miRNA和mRNA的內源對照。

1.2.4 遷移/侵襲實驗 根據制造商的說明書，使用不含或含Matrigel 的transwell 小室進行遷移/侵襲測定。轉染后24 h，用1×PBS 洗滌細胞，重懸于無血清培養基中并接種到上室（6×104細胞用于遷移，8×104細胞用于侵襲）。下室加入600 μL 含有20%FBS的HeLa 細胞或SiHa 細胞的培養基。溫育48 或72 h，將遷移/侵襲的細胞用75%甲醇-25%冰醋酸固定并用結晶紫染色。在顯微鏡下放大100 倍對5 個隨機選擇的視野進行成像，并在Nikon TE2000 顯微鏡下對遷移/侵襲的細胞計數。

1.2.5 集落形成實驗 在轉染后24 h，將HeLa 和SiHa 細胞以500 個cell/孔的密度接種到12 孔板中。每3 d 更換1 次新鮮培養基，持續兩周。用結晶紫染色，然后計算菌落形成率。

1.2.6 細胞周期實驗 轉染后24 h，用PBS 洗滌細胞3 次并用胰蛋白酶消化，然后用95%的乙醇固定過夜。PBS 洗滌細胞，并在PBS/0.05%Triton X-100 混合液中重懸，將細胞與不含DNA 酶的RNase A 在室溫下共溫育30 min，并用25 mg/mL 的碘化丙錠染色。室溫、黑暗中靜置30 min，然后用流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.2.7 Western blot 通過蛋白質印跡實驗檢測蛋白質的表達水平。轉染48 h 后，收集細胞，用RIPA裂解液在4 ℃條件下裂解30 min。在10%SDS-PAGE凝膠中分離等量的細胞裂解物，并轉移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂乳（TBST 稀釋）在室溫下封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，隨后，將膜與辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗在室溫下孵育2 h。通過增強的化學發光液檢測蛋白質表達，通過Image J 量化條帶強度。

1.3 統計學處理 所有統計分析均由Graphpad Prism 7.0 進行。使用配對Student’st檢驗評估對照組和實驗組之間的顯著性差異。P＜0.05 被認為具有統計學意義。數據顯示為來自至少3 次獨立實驗的x±s。

2 結果

2.1 miR-3685 抑制宮頸癌細胞的遷移/侵襲及生長構建 miR-3685 過表達質粒（pcDNA3/miR-3865）并商業合成其封閉劑（ASO-miR-3685），用RT-qPCR實驗檢測其有效性，結果表明質粒均有效（圖1A）。Transwell 遷移/侵襲實驗結果表明：過表達miR-3685可顯著抑制HeLa 和SiHa 細胞的遷移/侵襲能力，而封閉miR-3685 可促進HeLa 和SiHa 細胞的遷移/侵襲能力（遷移：圖1B,侵襲：圖1C）。Western blot 實驗（圖1D）、克隆形成實驗（圖1E）及細胞周期實驗（HeLa：圖1F，SiHa：圖1G）結果表明：過表達miR-3685能抑制HeLa 和SiHa 細胞的EMT 進程、集落形成能力及細胞周期進程，而封閉miR-3685 卻得到相反的結果。

圖1 miR-3685 對HeLa 和SiHa 細胞的遷移/侵襲能力、EMT 進程、集落形成能力及細胞周期進程的影響Fig 1 Effect of miR-3685 on migration/invasiveness,EMT progression,colony forming ability and cell cycle progression of HeLa andSiHacells

RT-qPCR 實驗檢測miR-3685 的過表達質粒及其封閉劑ASO-miR-3685 在HeLa 和SiHa 細胞中是否有效（A）；Transwell 實驗檢測過表達或封閉miR-3685 對宮頸癌細胞遷移（B）/侵襲（C）能力的影響；Western blot 實驗驗證過表達或封閉miR-3685對宮頸癌細胞EMT 進程的影響（D）；克隆形成實驗檢測miR-3685 對宮頸癌細胞集落形成能力的影響（E）；流式細胞術檢測miR-3685 對HeLa（F）和SiHa（G）細胞的細胞周期進程的影響（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。

2.2 CTTN 是miR-3685 的直接作用靶基因 為了進一步研究miR-3685 的潛在機制，使用miRBase 2.1 和TargetScan7.1 預測miR-3685 的潛在靶點,根據預測得分情況挑選了以下4 種候選靶基因，即CTTN,PRKAR2B,ULK2，RERE。在HeLa 細胞中將miR-3685 結合CTTN, PRKAR2B, ULK2，RERE 的3′UTR（WT）序列分別克隆到pcDNA3-EGFP 報告系統中，并在HeLa 細胞中與pcDNA3/miR-3685 共轉染,用Western blot 實驗評估這4 種候選靶基因的EGFP 蛋白表達水平。結果發現，相比其他3 種候選靶基因，用pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR 與pcDNA3/miR-3685 共轉時,EGFP 的蛋白表達水平降低的最明顯（圖2A），于是筆者初步選擇CTTN 作為miR-3685 的靶基因進行后續的驗靶實驗。在HeLa 細胞中將miR-3685 結合CTTN 的3′UTR(WT)或(mut)序列克隆到pcDNA3-EGFP 報告系統中，并在HeLa 細胞中與pcDNA3/miR-3685 或ASOmiR-3685 分別共轉染。進行Western blot 分析以評估CTTN 的EGFP 蛋白表達水平。miR-3685 與CTTN 野生型及其突變型之間的結合位點如圖2B所示。用pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR 與pcDNA3/miR-3685 共轉時，Western blot 實驗顯示EGFP 蛋白水平明顯降低，用pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR與ASO-miR-3685 共轉時, Western blot 實驗顯示EGFP 蛋白水平有所升高（圖2C）, 用pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR-mut 與pcDNA3/miR-3685 或ASO-miR-3685 共轉時, Western blot 實驗顯示EGFP 蛋白水平沒有明顯變化（圖2D）。筆者進一步測量了CTTN 的mRNA 表達水平和內源性蛋白表達水平，結果發現，過表達miR-3685 后，CTTN 的mRNA 表達水平和內源性蛋白表達水平明顯降低，而過表達ASO-miR-3685 后，CTTN 的mRNA 表達水平和內源性蛋白表達水平明顯升高(圖2E,F）。這些數據證明CTTN 是miR-3685 的直接靶標，并且它的表達受miR-3685 的負調節。

圖2 在HeLa 細胞中驗證CTTN 是miR-3685 的直接靶標Fig 2 Verify that CTTN is a direct target of miR-3685 in HeLa cells

用Western blot 實驗驗證4 種候選靶基因（CTTN, PRKAR2B, ULK2，RERE）的EGFP 蛋白表達水平的變化(A)；miR-3685 與CTTN 野生型及突變型之間的結合位點(B)；pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR 與pcDNA3/miR-3685 或ASO-miR-3685 共轉,用Western blot 實驗驗證EGFP 蛋白水平的變化(C)；pcDNA3-EGFP-CTTN-3′UTR-mut 與pcDNA3/miR-3685 或ASO-miR-3685 共轉，用Western blot實驗驗證EGFP 蛋白水平的變化(D)；在HeLa 細胞中轉染pcDNA3/miR-3685 或ASO-miR-3685 質粒，用RT-qPCR 和Western blot 實驗檢測CTTN 的mRNA（E）和內源性蛋白表達水平（F）變化（**P＜0.01，***P＜0.001,ns:無顯著性差異）。

2.3 CTTN 對宮頸癌細胞遷移/侵襲、EMT 進程、集落形成能力及細胞周期進程的影響 CTTN 的過表達和敲降質粒用于研究它們在宮頸癌細胞中的作用。通過RT-qPCR（圖3A）和Western blot（圖3B）實驗檢測其是否有效，結果表明質粒均有效。Transwell 遷移/侵襲實驗結果表明：過表達CTTN 促進了HeLa 和SiHa 細胞的遷移/侵襲能力，而敲降CTTN 抑制了HeLa 和SiHa 細胞的遷移/侵襲能力（遷移：圖3C，侵襲：圖3D）。Western blot 實驗（圖3E）、克隆形成實驗(圖3F)及細胞周期實驗(HeLa:圖3G,SiHa: 圖3H) 結果表明：過表達CTTN 可促進HeLa 和SiHa 細胞的EMT 進程、集落形成能力及細胞周期進程，敲降CTTN，得到相反的結果。

圖3 CTTN 對宮頸癌細胞遷移/侵襲、EMT 進程、集落形成能力及細胞周期進程的影響Fig 3 Effects of CTTN on migration/invasion, EMT progression,colony formingability and cell cycle progression of cervical cancer cells

RT-qPCR 實驗(A)和Western blot 實驗（B）檢測CTTN 的過表達質粒及其敲降質粒在HeLa 細胞中是否有效；過表達或敲降CTTN 對宮頸癌細胞遷移（C）/侵襲（D）能力的影響；Western blot 實驗驗證過表達或敲降CTTN 對宮頸癌細胞EMT 進程的影響（E）；克隆形成實驗檢測CTTN 對宮頸癌細胞集落形成能力的影響（F）；流式細胞術檢測CTTN 對HeLa（G）和SiHa（H）細胞的周期進程的影響（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。

3 討論

miRNA 在組織和細胞中通常都是異常表達的，這表明它們在臨床應用中可作為診斷、治療或預后的生物標志物[13]。比如，在肝癌中低表達的miR-193a-5p 與其患者的生存期縮短有關[14]，在結直腸癌細胞中，miR-25-3p 可促進結直腸細胞的血管通透性和血管生成，表明其具有潛在的癌癥進展價值[15]。miR-21siRNA 干擾載體可以抑制宮頸癌Hela 細胞中miR-21 基因的表達,促進細胞凋亡,延緩細胞周期進程[16]。本研究內容揭示了miR-3685 可以抑制宮頸癌細胞的遷移、侵襲、EMT 進程、細胞增殖以及細胞周期進程。這些結果為miR-3685 的功能作用提供了新的見解。

最近，有研究報道稱，在結腸癌細胞中，CTTN 可以通過invadopodia 形成而募集FMNL2 來加速肌動蛋白聚合和內體運動[17]，還有報道表明在結直腸癌中CTTN 可以通過激活EGFR-MAPK 途徑來促進細胞的增殖[18]。同時，一些特異性miRNA 也可以調節CTTN 的表達，例如，miR-182 可以通過調節CTTN的表達從而抑制肺癌的轉移、侵襲和增殖能力[19]，miR-542-3p 通過抑制cortactin 的表達抑制結直腸癌細胞的生長和侵襲[20]。在本研究內容中，揭示了CTTN 可以促進宮頸癌細胞的遷移、侵襲能力及生長。還揭示了miR-3685 對CTTN 的負性調控作用。

總之，本實驗結果首次證明了在宮頸癌中miR-3685 可以通過抑制CTTN 的表達而發揮抑癌作用。本研究強調了miR-3685-CTTN 軸在宮頸癌發病機制中的重要性。miR-3685 負調控CTTN 的表達可以為宮頸癌的治療及預防提供新的參考方向。