通腑湯對結腸吻合術后大鼠小腸推進率及結腸組織中NO含量、iNOS活性的影響

張平 姚成禮 譚琰 姚貴賓

[關鍵詞]通腑湯;結腸吻合術后;大鼠小腸推進率;結腸組織;NO含量;iNOS活性

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.05.090

術后胃腸功能障礙（postoperative gastrointestinal?disorder，PGD）是胃腸動力出現障礙的一種以非機械性梗阻為特征、胃腸排空障礙為主要表現的胃腸動力紊亂綜合征。胃腸神經功能平衡失調是其機制之一，胃腸電活動減弱，平滑肌細胞收縮受到抑制，胃腸平滑肌處于舒張的相對靜止狀態，進而產生腹脹、腸鳴音減弱或排便困難等，可進一步發展為早期術后腸梗阻[1]。一氧化氮（nitric?oxide，NO）是由一氧化氮合酶（nitric?oxide?synthase，NOS）催化L-精氨酸產生的氣體信號分子。NO作為非膽堿能非腎上腺神經遞質，在維持胃腸道正常運動中發揮重要作用。最近研究發現，NO濃度的大小影響胃腸功能，與多種胃腸道疾病關系緊密，因此胃腸組織NO的含量可能是PGD發病的重要機制，因此該研究方向成為關注熱點。臨床上對PGD多以對癥治療，緩解癥狀為主，采用改善胃腸道微循環、維持胃腸道生態平衡等治療，雖然.針對性強，但措施單一、治療局限[2]。中醫治療PGD具有整體觀念和辨證論治的特色，從宏觀的角度多靶點、多途徑防治，臨床療效確切。通腑湯是北京中醫藥大學第一附屬醫院李乃卿教授多年治療PGD的經驗方。“理氣通腑，養血和血”是其治療原則，臨床療效顯著。前期研究證實，通腑湯可以提高腸肌電活動、改善腸管收縮等途徑改善胃腸功能，發揮治療作用，但未從氣體信號分子層面進行研究，本實驗通過研究通腑湯對結腸吻合術模型大鼠小腸推進率及結腸組織NO含量的影響，從氣體信號分子調節角度探討通腑湯治療術后胃腸功能紊亂的作用與機制。現報告如下。

1材料與方法

1.1材料購買SPF級SD大鼠30只，雄性，8周齡，體重200-250g，適應性喂養1周后，禁食水12h，按完全隨機法分對照組和通腑湯組，每組15只。

1.2藥物制備通腑湯藥物組成：大黃10g、枳實15g、厚樸15g、芒硝10g、川棟子6g、炒萊菔子12g、木香6g、烏藥10g、陳皮10g、半夏10g、當歸10g、白芍12g，制備成含生藥量4.5g/kg的藥液。由北京中醫藥大學制備。所用中藥均由北京康仁堂藥業有限公司提供的中藥配方顆粒。符合2015年版<中國藥典>的相關要求。中藥用量參照<中藥藥理學實驗方法學>按實驗動物與人用藥量折算表計算，通腑湯中劑量給藥量為4.5g/kg。

1.3動物模型按照0.33ml/100g稱重，計算出各大鼠所需10%水合氯醛麻醉藥物劑量，于右下腹腔注射麻醉;檢查大鼠麻醉滿意后，將大鼠仰臥固定于手術板上，將下腹部暴露，不需提前剪毛，用組織剪在大鼠中下腹正中剪開長約2cm切口，找到盲腸下2cm處結腸，剪斷后原位一層縫合法縫合，腹膜和肌層連續縫合，間斷縫合皮層。術后大鼠背部皮下注射2萬IU/kg青霉素G鈉和250mg/kg硫酸鏈霉素，連續3d;術后48h內禁食不禁水，早晚分別灌胃20%葡萄糖溶液2次，間隔8h，第3天灌胃飼料糊20ml/kg（標準飼料超微粉碎，配制20%飼料糊），第4天自由飲食。

1.4實驗方法術后6h開始干預，通腑湯組大鼠以4.5gkg劑量灌胃，灌服藥物劑量根據實驗動物與人相同體表面積折算，即200g大鼠所需劑量相當于成人量（70kg）x0.018，然后通腑湯組大鼠予通腑湯4.5ml/kg灌胃治療，對照組給予等體積溫水4.5ml/kg灌胃，1次/d，連續7d。末次給藥后24h，實驗大鼠均用碳素墨水按1ml/只的劑量灌胃，30min后處死。.1.5標本采集取大鼠結腸手術部位組織，冰凍0.9%氯化鈉（NaCI）溶液漂洗。用濾紙快速吸干，按重量（g）：體積（m）為1：9的比例加0.9%NaCl溶液制成10%的組織勻漿液，低溫3000r/min離心15min，取上清液置于-209待測。

1.6檢測指標

1.6.1小腸推進率測定小腸推進率=幽門至碳末前端的距離+小腸全長x100%。操作：將幽門至回盲部的小腸，放人測量容器中，測量墨水在腸管內的移動的距離和小腸全長。

1.6.2結腸組織NO含量測定NO含量（umol/g）=[（測定管吸光度一空白管吸光度）+（標準管吸光度一空白管吸光度）]x標準品濃度（20umol/g）x樣本的蛋白含量（g/L）。操作：依據試劑盒配制標準品說明，測定管內滴加樣本、相關試劑，于37C水浴60min，再加入滴試劑混勻離心，取上清加顯色劑，在調至550nm波長的多功能酶標儀上進行比色。

1.6.3結腸組織誘導型一氧化氮合酶iNOS活性測定NOS活力（U/mg）=[（測定管吸光度一空白管吸光度）/呈色物納摩爾消光系數]x（反應液總體積/取樣量）+（比色光徑x反應時間）+蛋白含量（mg/L）。操作：依據試劑盒說明書，將試劑加人測定管混勻，于37C水浴15min，再加透明劑、終止液混勻，蒸餾水調零，在530nm波長處測定各管的吸光度OD值。

1.7統計學方法采用SPSS16.0統計學軟件對數據進行處理。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，作方差齊性和正態性檢驗，滿足方差齊性以one-way?ANOVA法進行方差分析，不滿足方差齊性則以非參數法檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組大鼠小腸推進率比較通腑湯組大鼠的小腸推進率為（76.28±5.60）%，顯著高于對照組的（59.32±7.54）%，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1，圖1。

2.2兩組大鼠結腸組織NO含量比較通腑湯組大鼠的結腸組織NO含量（5.30±1.12）umol/g明顯低于對照組的（18.34±2.11）umol/g，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表2，圖2。

2.3兩組大鼠結腸組織iNOs活性比較通腑湯組大鼠的結腸組織iNOs活性（10.55±1.41）umol/g明顯低于對照組的（19.56±4.32）umol/g，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表3，圖3。

3討論

腸神經系統（enterie nervous?system，ENS）是調節胃腸運動，使消化系統功能正常運行的三大神經系統之一。NO在胃腸道分布廣泛，是NOS的產物，是ENS主要的非腎上腺素能非膽堿能神經遞質。通過非傳統接頭后功能受體活化可溶性鳥苷酸環化酶（sGC），然后將三磷酸鳥苷（GTP）分解生成環磷酸鳥苷（cGMP），激活蛋白激酶G，降低Ca2+敏感性和激活K*通道[3]，進而發揮抑制性神經遞質的作用，抑制胃腸動力，延緩胃排空。然而NO具有細胞保護和細胞毒性的雙重效應。生理條件下，NO作為一種內源性介質調節組織的修復及其完整性。由于NO沒有專門的儲存及釋放調節機制，靶細胞上NO的多少直接與NO的生成量有關。iNOS是產生NO的主要合成酶，生理條件下iNoS并不表達，在應激和炎性反應情況下，巨噬細胞和腸平滑肌細胞生成大量的iNOS[4]，產生高濃度NO，并與超氧陰離子結合成亞硝酸陰離子，并質子化形成具有強氧化性的過氧亞硝酸，蛻變為自由基，通過自由基鏈式反應導致含巰基蛋白和脂質過氧化，造成組織細胞損傷。因此，胃腸道的許多病理過程與高濃度的NO有關[5]。

中醫對PGD的辯證分型目前尚未統一。李乃卿教授認為腹部手術擾亂了體內正常的氣機運行，損耗胃腸氣血，肝氣失于疏泄，脾胃失于運化，腑氣壅塞不暢而發病。氣血虧虛為本，氣滯血瘀、腑氣不通為標。確立了“理氣通腑，養血和血”的治療原則。創立有獨特療效的經驗方一通腑湯[6]。

本實驗通過對大鼠行結腸吻合術，引起大鼠結腸組織中NO含量和iNOS活性升高，造成大鼠胃腸功能減弱，胃腸排空障礙。觀察術后盡早給與大鼠通腑湯灌胃對小腸推進率及結腸組織中NO含量和iNOS活性的影響。研究表明，與對照組相比通腑湯組大鼠小腸推進率顯著增大，結腸組織中NO含量及iNOS活性明顯升高。

綜上所述，通腑湯通過抑制iNOS活性，減少NO產生和釋放發揮重要作用，從而促進胃腸蠕動，治療術后胃腸功能紊亂。

參考文獻

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[收稿日期：2019-09-29]