魚苗規格對草魚細菌二聯苗浸泡免疫接種效果影響

鞏 華 鐘國東 趙長臣 江小燕 賴迎迢

(1.中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業部漁藥創制重點實驗室，廣東省免疫技術重點實驗室，廣東 廣州 510380；2.韶關市始興縣農業農村局，始興縣魚類繁育良種場，廣東 韶關 512500)

魚用疫苗因其可安全有效地預防水產養殖動物疫病，已成為國際上水產疫病防控的主流技術。其中，浸泡免疫可對魚群進行免疫，操作簡單、短時間內實現批量接種、對魚刺激小、魚種接種效果更佳，具有良好的推廣價值，目前在歐美、東亞等不少國家和地區都有商品化產品，都有浸泡免疫操作方法推薦(吳淑勤等，2014)。浸泡免疫接種時，疫苗效力存在許多變量，其中受免魚的大小是重要考慮因素之一。特別是浸泡免疫過程中，通過大量研究表明，抗原攝取主要依賴于吞噬作用經過黏膜組織如硬骨魚的鰓、皮膚、側線和胃腸道(B?gwald J等，2019)，其系統發育是否完善嚴重影響免疫應答效果。

草魚嗜水氣單胞菌敗血癥、銅綠假單胞菌赤皮病二聯蜂膠滅活疫苗(GA201 株＋JP802 株)在小樣本、小范圍、環境恒定可控條件下的浸泡免疫安全性、效力等試驗表明，該疫苗對草魚安全、有效。為科學評價該疫苗在實際生產應用中的安全性、效力和使用效果，筆者開展了不同規格的草魚種浸泡免疫的效果試驗，評估該疫苗在草魚產業中的操作使用參數值，以期為生產實踐和科學研究等提供數據支撐。

一、材料與方法

1.試驗材料

(1)疫苗。草魚嗜水氣單胞菌敗血癥、銅綠假單胞菌赤皮病二聯蜂膠滅活疫苗(GA201 株＋JP802 株)均為中國水產科學研究院水產疫苗工程技術中心試制產品，經安全性檢驗和效力檢驗合格。

(2)苗種培育池。池塘位于韶關市始興省級良種場生產車間內，為泥底池塘、水泥護坡。池塘面積為5 畝，水深2 米左右，配置葉輪式增氧機1～2 臺，在距離投餌機20 米處安裝1 臺水車式增氧機。試驗前全池潑灑生石灰清塘。

(3)草魚苗種。自繁水花培育至0.35 克/尾，魚群采食、游泳正常，無其他傳染病。漁場按正常免疫程序進行免疫，經檢測無攜帶草魚出血病呼腸孤病毒、嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌等病原后，分別準備規格0.35 克/尾(7 朝)、0.65 克/尾(8 朝)、1.05 克/尾(9 朝)、2.30 克/尾(10 朝)的草魚苗種。

2.試驗方法

(1)試驗分組。試驗方案見表1。

表1 試驗分組與處理情況統計

(2)飼養管理。控料投喂，投餌率為5%～8%，每天7:00、11:30、16:00 按1∶1∶1 均勻投喂。內服保健主要為復合多維和乳酸菌、酵母菌等微生態制劑。

(3)水質管理。墨江水經引流、沉淀、過濾后引入池塘，生石灰潑灑調節堿度120～150毫摩爾/升、硬度80～120毫摩爾/升、pH 7.5～8.5。日常檢測水質，當氨氮、亞硝酸鹽超過規定范圍即調水、換水，pH 超出范圍則用碳酸氫鈉和生物酸調節，溶氧超出范圍則調整增氧機的開關時間，透明度超出范圍則進行換水。每10～15 天換水1次，一般每次換水30厘米。

(4)浸泡免疫。按照產品使用說明，配制0.5%的食鹽水(100升水加1千克食鹽)，加入10瓶疫苗(100 毫升/瓶)，浸泡魚苗20 分鐘，完成100 千克魚苗浸泡，浸泡過程中要不間斷充氣。

(5)健康狀況。觀察魚體健康狀況，特別是免疫接種后觀察魚群的精神、采食、游泳情況，觀察有無應激反應、是否出現死亡。通常早晨、傍晚及投料攝食期間為最佳觀察時間，靜候在塘邊下風處，觀察草魚的活動情況，若疫苗安全性不佳，能見病魚出現；靜候投料臺邊觀察草魚攝食情況，以判斷魚的健康狀態。

(6)統計免疫后死亡情況。每天記錄各組的死亡數，1個月后計算各組死亡率，按下列公式計算免疫相對保護率。

(7)內臟解剖。出現死亡后，魚的肝、脾、腎和腸道等器官充血、糜爛，有腹水。兩個月后試驗結束時，每批各隨機取20 尾試驗魚進行剖檢，觀察注射部位有無炎性反應或其他反應，并觀察各臟器是否正常。

二、結果

1.養殖期間水質與管理情況

試驗期間(6－7月)水溫受到季節影響，7月晴天1.5 天，多云11.5 天，其余都是雨天，雨天比較多，7 月26－30 日氣溫達到37℃以上，水溫保持在26℃左右，增氧機開得比較多，會影響草魚苗的成活率。中間培育過程中，由于考慮到高溫雨季，根據經驗放苗密度不大，整個過程中沒有出現大的問題，試驗期間4號池和6號池發生車輪蟲病，對所有試驗池使用硫酸銅殺蟲后，沒有發生其他傳染病。

2.浸泡免疫對魚苗成活率的影響

本試驗各種規格的草魚苗合計36 萬尾，其中浸泡免疫18 萬尾，在試驗1 個月后，開始陸續出苗，發送到粵北、贛南、湘南等地區，由于距離和時間關系，沒有一一追蹤。1個月的試驗時間內生產情況如表2所示。從統計結果來看，免疫后成活率都有增長，8 朝苗以上保護率可達30%以上，9朝苗的免疫保護率最高，可達50.20%。在本場內草魚種生長良好，體長達10～12 厘米，成活率達到75%以上。

3.浸泡免疫對魚苗生長的影響

本試驗免疫操作過程適逢雨季，天氣變化快，悶熱天氣氣壓低，因此免疫接種需要全過程不間斷增氧。在養殖期間魚苗生長良好，免疫組和非免組餌料系數均在1.5 以上(圖1)，差異不顯著(P＞0.05)。從規格上看，免疫處理后對生長的影響不大，由于7 號、8 號對照池的成活率不高，其養殖密度降低，養成的規格反而大于免疫組，可見密度才是影響其生長的主要因素。

圖1 試驗期間各養殖池餌料系數統計

4.魚類解剖結果

試驗結束時隨機取樣檢測表觀健康的魚苗，魚苗內臟完好，無出血、腹水等炎性反應；腸道內有食物，可見其攝食正常；鰓基本正常(圖2)。各個池塘內均有少量魚有黏液增多現象，可能由于雨季或其他原因引起的應激反應。

圖2 魚苗培育后的解剖情況(2號池、6號池)

表2 各組生產情況統計

三、討論

免疫系統發育是決定起始免疫時間的重要因素之一，20 世紀80 年代有學者開展魚類免疫系統發育研究。免疫系統未發育完善進行免疫易產生免疫耐受(吳淑勤等，2014)。免疫耐受是指對抗原特異應答的T細胞和B細胞接受某種抗原刺激后表現出的特異性免疫低應答或無應答狀態，即機體對某種抗原無免疫應答的狀態。一般研究參考陸生動物指標，以魚體孵化后的日齡作為免疫操作的指標，如鯉魚受精后2 天可見免疫器官，3～8 個月免疫器官發育成熟，但4 周齡鯉魚免疫后產生抗原耐受(Becker K等，2001)。

也有研究認為，魚體規格(體重或體長)大小是獲得免疫應答能力的關鍵因素。Nuno等(2001)接種個體重大于1克的鮭魚和0.5克的鱸魚才能成功獲得特異性免疫，且體重與免疫應答效果正相關，推測能產生免疫應答的最小體重與免疫器官發育成熟日齡相一致。免疫器官發育成熟日齡和體重可作為起始免疫適宜時間和規格指標參數。草魚、鯉的頭腎發育不同于恒溫動物，不只受到日齡的影響，其他內外環境因素對器官生理的影響也至關重要(雷學彬等，2012)，因而用全長或體質量等形態學指標作為頭腎等免疫系統發育的參考十分必要。

珠三角地區草魚養殖通過多年的積累和實踐，形成了清晰的草魚朝苗養殖判定標準，并廣泛運用于草魚苗的標粗階段(把剛剛孵化并開口的魚苗培育到體長10厘米左右的魚種階段)，并對草魚朝苗不同規格的過篩形成行業內標準化操作。苗種成活率是草魚苗種培育最為關注的課題，成活率的高低關系著養殖成本、養殖產量的高低、出售規格的大小、魚價行情的把握，是整個草魚養殖環節中最為重要的一環，以苗種成活率來評價所采取的措施是最基礎的評價方式之一。在本試驗中，8朝苗以上保護率可達30%以上，9朝苗的免疫保護率最高，可達50.20%。因此該疫苗聯合使用浸泡免疫接種時，魚種的規格在9 朝左右為宜。