2016-2017年四川地區規模化豬場常見病原流行病學調查

江地科，項明源，王 印*，姚學萍，楊澤曉，張鵬飛，廖倡宇，鄔旭龍*

(1．四川農業大學動物醫學院，四川 溫江 611130; 2．動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 溫江 611130)

【研究意義】近年來，我國養豬業規模化程度不斷提高、畜產品流通異常頻繁的同時，病原感染情況也在持續增長，表現為單一病原感染或者多種疾病混合感染以及新變異株的頻繁出現。如豬瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)、豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneuromoniae，APP)、豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type 2, SS2)、豬多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida, Pm)等疾病都是造成豬群呼吸道疾病的主要病原[1]。同時，CSFV、PRRSV、PRV、PCV2也是引起豬繁殖障礙疾病的病原之一[2]。豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus, PoRV)的感染造成豬群嘔吐、腹瀉、脫水，具有較高的致死率[3-4]。目前關于四川省養豬業的疾病流行情況調查，現有研究主要針對單一系統性病原調查，【前人研究進展】如：豬群呼吸系統疾病病原調查與分析、豬群繁殖系統疾病病原調查與分析、豬群腹瀉病原調查與分析，但未見對豬群各系統主要流行疾病做出全面的調查與分析[5-7]。【本研究切入點】本研究擬采用細菌分離鑒定、RT-PCR和PCR，對四川省2016年1月至2017年12月12個地區的規模化豬場送檢病料進行相關病原學檢測，調查各病原陽性率，分析疾病發生的季節規律。【擬解決的關鍵問題】為四川地區豬群相關病原的防控提供有效參考依據，降低疫病給養豬業帶來的經濟損失。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料樣本分別來自2016年1月至2017年12月期間，四川省成都、遂寧、西昌、樂山、綿陽、南充、德陽等12個地區規模化養豬場共283份發病病料，其中病死豬病變組織106份(肺、腎、肝、脾、心等)、公豬精液68份、流產胎和死胎63份、腹瀉豬腸黏膜和糞便46份。CSFV、PRRSV、PRRSV NADC30-Like、PCV2、PRV、Pm、SS2、 APP、PEDV和PoRV陽性樣品為本實驗室保存。

1.2 主要試劑與培養基

反轉錄酶試劑盒、TSA培養基、蛋白酶K、Tris飽和酚購自寶生物工程(大連)有限公司DL2000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix 購自北京天根生化科技有限公司；小牛血清購自GIBCO公司；異丙醇、三氯甲烷等均由四川西隴化工有限公司生產。

1.3 引物

分別參照GenBank中登錄的各病原參考株保守基因序列并參考文獻[8-11]進行引物設計與合成，引物送由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

1.4 細菌的分離鑒定

取病變肺組織劃線接種于TSA培養基，37 ℃分別進行需氧與厭氧培養，24～48 h后觀察菌落形態，挑取單個菌落進行革蘭染色鏡檢并純化，提取細菌基因組DNA，-20 ℃保存。

1.5 病料DNA/RNA核酸提取

采用蛋白酶K/Trizol方法提取病料樣品總DNA/RNA，-20 ℃保存[12]。

1.6 PCR/RT-PCR擴增

以1.5提取的病料樣品基因組DNA為模板(提取的RNA反轉錄成cDNA)，進行相應樣品病原的擴增。PCR反應體系為20 μl：2×TaqPCR Master Mix 10 μl，上、下游引物序列各1.5 μl，模板2 μl，加ddH2O補至20 μl。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；退火(表1)30 s；延伸72 ℃ 1 min，共34個循環；72 ℃ 10 min；4℃保存。取5 μl PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 PCR結果

2.1.1 細菌基因PCR擴增結果 將細菌DNA分別進行PCR擴增，凝膠電泳結果顯示分別出現了約為364、495、464 bp的片段，與陽性對照相符，陰性對照無特異性片段出現(圖1)。結果顯示，分離菌株分別為APP、SS2、Pm。

2.1.2 病毒基因PCR擴增結果 將病料樣品RNA/DNA，進行RT-PCR/PCR擴增，結果顯示擴增條帶分別約為192、400、868、1154、553、774、297 bp，與陽性對照相符，陰性對照均無特異性片段出現(圖2)。結果顯示，CSFV、PRRSV、PRRSV NADC30-Like、PCV2、PRV、PEDV、PoRV為陽性。

表1 引物序列Table 1 The sequences of Prime

M.DL2000 DNA marker; 1,4,7.APP,SS2,Pm陽性對照; 2,5,8.陰性對照;3,6,9.樣品M.DL2000 DNA marker; 1,4,7.APP, SS2, Pm Positive control; 2,5,8.Negative control;3,6,9.Samples圖1 APP,SS2,Pm基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification of APP, SS2, Pm gene

2.2 病死豬病變組織病原檢測結果

2.2.1 病死豬病變組織病原分離統計結果 共檢測臨床病料106份(心、肝、脾、肺、腎、淋巴結等)。結果顯示，病毒PCR檢測中 PCV2、PRRSV、PRRSV NADC30-Like、PRV陽性率較高，分別為34.91 %(37/106)、40.57 %(43/106)、20.75 %(22/106)、16.04 %(17/106)(表2)。其中，PRRSV NADC30-Like變異株陽性率20.75 %，是造成豬群死亡的重要原因之一。在細菌分離中，Pm陽性率最高，為19.81 %(21/106)。

2.2.2 病死豬病變組織病料在不同季節病原檢測結果 統計以上幾種病原在不同季節的陽性率。結果顯示，PCV2無明顯的季節性，一年四季均可感染；PRV在冬季感染率較高，為28.57 %(10/35)；CSFV在各個季節的感染率均較低；PRRSV在春季、秋季和冬季感染率較高，分別55 %(11/20)、45 %(18/40)、34.29 %(12/35)；PRRSV NADC30-Like在夏季和冬季感染率較高，分別為36.36 %(4/11)和28.57 %(10/35)；Pm在春季和冬季感染率較高為40 %(8/20)和28.57 %(10/35)；APP在夏季感染率較高為27.27 %；SS2在各個季節的感染率均較低(表3)。

2.2.3 病死豬病變組織病料感染結果 豬群發病與死亡的主要原因以病原混合感染為主，混合感染率為60.49 %(49/81)。結果顯示，多以二重感染類型為主，占61.22 %(30/49)。此外，PRRSV和PCV2混合其他病原感染最為常見，分別占混合感染樣品的44.90 %(22/49)和51.02 %(25/49) (表4)。

2.3 公豬精液病原檢測結果

2.3.1 公豬精液病原分離統計結果 共檢測精液68份。病毒PCR檢測中PCV2、PRRSV、PRV陽性率較高，分別為20.59 %(14/68)、30.88 %(21/68)、20.59 %(14/68)。CSFV較低，為10.29 %(7/68)(表2)。

M.DL2000 DNA marker;1,4,7,10,13,16,19.CSFV,PRRSV,NADC30-Like,PCV2,PRV,PEDV,PoRV陽性對照；2,5,8,11,14,17,20.陰性對照；3,6,9,12,15,18,21.樣品M， DL2000 DNA marker; 1,4,7,10,13,16,19.CSFV,PRRSV,PRSSV NADC-30,PCV2,PRV,PEDV,PoRV Positive control; 2,5,8,11,14,17,20.Negative control;3,6,9,12,15,18,21.Samples圖2 CSFV,PRRSV,PRSSV NADC-30,PCV2,PRV,PEDV, PoRV 基因PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification of CSFV,PRRSV,PRSSV NADC-30,PCV2,PRV,PEDV,PoRV gene

表2 不同病原檢測結果Table 2 Results of etiological survey of different pathogens

2.3.2 公豬精液病料在不同季節病原檢測結果 統計以上幾種病原在不同季節的陽性率。結果顯示，CSFV在各個季節感染率均較低；PCV2在秋季和冬季感染率較高，分別為31.25 %(5/16)和27.78 %(5/18)；PRRSV在夏季感染率最高，達到70.59 %(12/17)； PRV在夏季、秋季、冬季感染率較高，分別為23.53 %(4/17)、31.25 %(5/16)和27.78 %(5/18)(表3)。

2.3.3 公豬精液病料感染結果 公豬精液帶毒主要是由單一病原感染為主，單一感染率為52.63 %(20/38)。PRRSV感染率最高，為45 %(9/20)(表4)。

2.4 流產胎、死胎病原檢測結果

2.4.1 流產胎、死胎病原分離統計結果 共檢測病料63份。結果顯示，病毒PCR檢測中 PCV2、PRRSV、PRV陽性率較高，分別為38.10 %(24/63)、46.03 %(29/63)、30.16 %(19/63)。CSFV較低，為6.35 %(4/63)(表2)。

2.4.2 流產胎、死胎病料在不同季節病原檢測結果 統計以上幾種疾病在不同季節的陽性率。結果顯示，CSFV在一年四季基本平靜；PRRSV在一年四季均可感染，其中夏季感染率最高為70 %(7/10)；PCV2在夏季、秋季和冬季呈較高感染率，分別為70 %(7/10)、57.14 %(8/14)和38.89 %(7/18)；PRV無明顯的季節性，一年四季均可感染(表3)。

2.4.3 流產胎、死胎病原感染結果 仔豬流產和死亡的主要原因是由病原混合感染為主，混合感染率為74.50 %(38/51)。結果顯示，以二重和三重感染為主，分別占55.26 %(21/38)和31.58 %(12/38)。以PRRSV混合其他病感染最為常見，分別占混合感染樣品的44.74 %(17/38)(表4)。

表3 不同時間病原檢測結果Table 3 Results of etiological investigation of different pathogens of different seasons

表4 不同病原混合感染檢測結果Table 4 Results of mixed infection of different pathogens

2.5 腹瀉豬腸黏膜和糞便病原檢測結果

2.5.1 腹瀉豬腸黏膜和糞便病原分離統計結果 共檢測腹瀉病料46份。結果顯示，PEDV陽性率最高，為56.52 %(26/46)。PoRV陽性率為26.09 %(12/46)。

2.5.2 腹瀉豬腸黏膜和糞便病料在不同季節病原檢測結果 統計以上兩種病原在不同季節的陽性率。PEDV在春季、秋季和冬季感染率較高，分別為45.45 %(5/11)、28.57 %(2/7)和82.61 %(19/23)；PoRV在春季、秋季和冬季感染率較高，分別為36.36 %(4/11)、28.57 %(2/7)和34.78 %(8/23)。據報道，PEDV具有季節流行性，大多數流行于冬季、春季，但從本次研究結果來看，PEDV除了在冬、春季節流行外，在秋季也多發。

3 討 論

病死豬病變組織病原調查結果顯示，PRRSV陽性率最高，為40.57 %。有研究表明PRRSV可導致感染豬群免疫受到抑制、降低機體免疫力與抵抗力從而導致細菌侵入機體，引發繼發性感染，造成豬群大規模死亡[13]。楊漢春等人報道2016年，我國東北部部分地區豬繁殖與呼吸綜合征病毒類-NADC30毒株陽性率高達18 %，該毒株持續流行與傳播，疫情涉及地區包括北京、河北、山西、四川、廣東、河南、福建等地[14]。本研究調查結果顯示，PRRSV NADC30-like陽性率為20 %，表明該毒株在四川地區已逐漸呈流行趨勢，此外，Zhou Lei等研究表明目前商業PRRSV疫苗不能為NADC30-like提供全面的保護，也是導致豬群死亡的重要原因之一[15]。細菌分離鑒定結果顯示，Pm陽性率最高：19.81 %，遠高于官正對四川川東部分規模化養殖場豬呼吸道混合感染中Pm(0.55 %)的調查結果[16]。值得注意的是，在細菌分離鑒定過程中，通過PCR也檢測到APP、SS2和PRRSV、PCV2等病原混合感染，多以PCV2和Pm二重感染為主，推測其致病過程，可能是由PRRSV和PCV2等病毒性疾病引起豬群免疫受到抑制，使機體免疫降低，從而導致細菌侵入引起繼發性感染。

公豬精液與流產胎、死胎病原調查結果顯示，PRRSV陽性率最高，陽性率分別為：30.88 %、46.03 %。宋玉慧等對146份臨床疑似豬繁殖障礙性疾病的病料調查結果顯示，PRRSV陽性率最高，為40.41 %[17]。吳永剛等對四川省部分地區公豬精液六種病毒性疾病的分子檢測，結果顯示PRRSV陽性率為11.90 %[18]。本研究調查結果表明，引起規模化豬場豬群繁殖障礙疾病主要是以二重感染為主，以PRRSV感染其他病原最為常見。其中，公豬感染繁殖障礙疾病病原后，通常情況下并不表現明顯的臨床癥狀，但可作為病毒攜帶體，通過與母豬交配或人工受精將病原傳給母豬，病原經胎盤屏障垂直傳播給胎兒，從而引發母豬流產、產死胎和木乃伊等繁殖障礙疾病，是引起目前規模化豬場繁殖障礙性疾病高發病率與死亡率的原因[19-20]。

腹瀉豬腸黏膜和糞便病原調查結果顯示，PEDV陽性率最高為56.52 %，且主要呈單一感染，是引起豬群腹瀉死亡的主要病原。劉云波等、常鐵城、曹恭貌等對我國部分地區豬場腹瀉病毒感染狀況調查結果顯示，PEDV陽性率最高[21-23]。此外，Sun等研究證明母豬乳汁也能檢測到PEDV，所以PEDV可能通過母乳傳播[24]。本研究通過對四川地區部分規模化豬場常見病原的流行病學調查，為相應豬場在疾病防控、流行情況提供一定的科學依據。

4 結 論

本研究主要通過規模化豬場的“豬群呼吸系統疾病病原”、“豬群繁殖系統疾病病原”、“豬群腹瀉病原” 三大板塊進行調查與分析，發現引起豬群呼吸道疾病和豬群繁殖系統疾病的主要病原還是PRRSV或者是PRRSV混合其他病原進行混合感染，引起豬群腹瀉疾病的病原主要還是PEDV。但通過調查發現PRRSV NADC30-like陽性率為20 %，具有上升趨勢。本研究通過對四川地區部分規模化豬場常見病源的流行病學調查，為相應豬場在疾病防控、流行情況提供一定的科學依據。