利用EST-SSR檢測闊短和狹長被片型美洲蓮的遺傳變異

劉鳳欒，秦 密，劉青青，張大生，田代科

(上海辰山植物園，中國科學院上海辰山植物科學研究中心，上海市資源植物功能基因組學重點實驗室，上海 201602)

花被片形狀(被形)作為花型的主要組成部分之一，對觀花植物的觀賞性有重要影響。雖然荷花(NelumboAdans.)正式文獻記載的名稱全球已達2 080個[1]，但因受限于原種型色單調[2]、品種譜系不清、育種工作缺乏系統性與針對性、分子育種尚無突破等原因，現有荷花的被形變化小、多樣性低，多為卵形、匙形或寬披針形等中間形狀[3]，而極少見圓闊月季瓣類和狹長菊瓣類。因此，與菊花和月季相比，在某種程度上荷花的花朵觀賞性偏低，不能滿足現代社會對新穎性、奇特性事物的追求[4]，從而制約了觀賞荷花產業的可持續發展。因此，以特殊花被片形狀(被形)為切入點，創制闊短或狹長被形新種質，是提高荷花觀賞性及其應用價值的良好途徑之一。

進入21世紀，荷花育種工作受到越來越多的國家和育種者重視。以人工有性雜交和自然雜交篩選為主[5-8]、人工射線輻射處理和太空輻射育種為輔[9-10]，獲得一批優良的荷花品種。觀賞植物資源與創新利用課題組也正致力于奇異獨特觀賞荷花品種尤其是極端被形荷花良種的選育工作，研究期間，在位于上海辰山植物園的荷花資源圃偶然發現闊短和狹長花被片美洲蓮(N.luteaWilld.)實生苗各1株，為選育菊瓣和月季瓣類型荷花品種提供了極佳的親本材料。兩者哪些形態學特征存在顯著不同，在DNA和RNA水平上是否存在差異，能否篩選到與被形發育相關的分子標記或定位到其調控基因？通過研究這些問題，將對利用分子標記輔助選育獨特被形荷花新品種，以及探討荷花被形發育的分子調控機理具有重要意義。

SSR(簡單序列重復)標記又稱微衛星DNA(Microsatellite DNA)，是指真核生物基因組中散在分布的由1～6個堿基對組成的簡單重復序列，其多態性源于堿基基序重復次數的不同。根據開發來源可分為基因組SSR(gSSR)和轉錄組SSR(EST-SSR)。EST-SSR作為一種與基因表達相關的SSR標記，除具備傳統gSSR的共顯性、多態性高、重復性好等特點外，還有通用性高、性狀連鎖和開發經濟等優勢。觀賞植物資源與創新利用課題組依據不同時期花蕾轉錄組測序結果自主開發和篩選了217對EST-SSR引物[11]，并得到很好的應用與檢驗[12]，為本研究提供了可靠的參考。

本研究以闊短被形和狹長被形的兩個美洲蓮特殊株系為材料，在比較兩者形態特征差異的基礎上，對課題組開發的217個EST-SSR標記進行多態性篩選，通過比較多態性位點的生物學信息，初步確定，闊短被形和狹長被形兩個株系在DNA水平是否存在差異，以評估分子標記構建連鎖圖譜的可行性，以及后續全基因組重測序和轉綠組水平比較的必要性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2015年課題組于上海辰山植物園“國際荷花資源圃”發現兩株花被片形狀(被形)差異顯著的美洲蓮(N.luteaWilld.)，為美國野生居群采集的蓮子播種培育而來。與常見的美洲蓮相比，一株被形較為闊短，栽培編號M512；另一株則明顯狹長，栽培編號為DP23，兩者自交系的被形均可穩定遺傳。利用種藕分株，分別將此兩種類型定植于3個塑料池中(長×寬×深=100 cm× 80 cm×45 cm)栽培以供觀察研究。

1.2 試驗方法

1.2.1 闊短被形和狹長被形株系主要形態學性狀的比較測定 形態指標以花朵和葉片的關鍵表型為主(表1)。花朵性狀于花開第2天測量，其中花被片長度以其基部至尖部為準，寬度以花被片最寬處為準，因其最外側5～6枚開花時易失水變形，為減小測量誤差，自第6～7枚花被片開始測量。花被片數和雄蕊數：為防止外層花被(萼片狀)過早脫落，將出水后的花蕾套入網兜內，開花前1～2 d采收統計；花柄/葉柄高度：自池底到花托基部/葉鼻處的長度；花柄/葉柄粗度：花柄/葉柄在水面附近的粗度；葉脈數：每片葉的主葉脈數量；自交結實率：人工自花授粉結實后成熟花托內飽滿果實數與其雌蕊數之比；果實單粒質量：隨機取10粒果實稱取得到的粒均質量。

1.2.2 多態性EST-SSR引物的篩選 于“國際荷花資源圃”采集M512和DP23心形拳卷狀態的幼嫩荷葉，每種類型3池各采1片等體積混合后液氮研磨。利用改良的CTAB法[13]提取基因組DNA，稀釋至50 ng/ μL。為檢測兩個自交系是否在功能基因上存在核苷酸序列差異，選擇217對基于荷花轉錄組開發的EST-SSR引物[11]展開多態性分析。PCR擴增反應總體積為10 μL：5 μL 2×ESTaqmix (北京康為)，DNA模板1.0 μL，引物0.5 μL (10 μmol/L)，3.5 μL ddH2O。反應程序為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；最終72 ℃延伸5 min。擴增產物加入6 μL變性劑，94 ℃變性5 min，置于冰上冷卻后，于6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染-NaOH顯色。根據電泳圖，確定呈現多態性的EST-SSR引物。

1.2.3 特異條帶的生物信息學分析 將具有多態性的PCR產物進行雙向測序，以最大程度保證其核苷酸序列信息的真實性。將所得的差異序列片段，在NCBI網站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中Blast比對查找序列相同或高相似度的基因或片段Gene-x，再根據已有研究報道，明確Gene-x的基因功能。若無法在NCBI中直接比對得到高相似度Gene-X，則于荷花基因組數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/14095)中搜索高相似度的基因或片段Gene-y，然后再于NCBI網站中利用Gene-y進行Blast，查詢Gene-x及其功能。

2 結果與分析

2.1 M512和DP23主要形態指標差異

在測定的20個形態指標中，花被片寬長比、花被片寬長均值及果實單粒質量等12個指標在兩個自交系之間存在顯著差異，其中花朵為差異最直觀、顯著的器官(圖1，表1)。M512花被片表現為較寬較短，其寬長比均值為0.68，花被片寬度×長度變幅為4.3～7.7 × 6.7～10.2 cm；DP23花被片偏窄偏長，其寬長比均值為 0.35，花被片寬度×長度變幅為3.1～5.2×10.0～14.8cm(表1)。除花朵外，每池立葉密度、立葉葉脈數和柄孔數等3個葉片指標也存在顯著差異(表1)。由此可見，兩個自交系的主要形態特征在個體水平上存在明顯區別。

圖1 闊短被形M512和狹長被形DP23的花蕾及花朵Fig.1 Buds and flowers of M512 and DP23

2.2 多態性EST-SSR引物的特征及其擴增產物的多態性

與形態差異相應，217對備選的EST-SSR引物中，26對引物擴增產物在M512和DP23之間也表現出條帶多態性(圖2，表2)，多態性比率為12.0%。其中，24對引物擴增得到2個等位基因，剩余2對引物擴增得到3個等位基因。將這些多態性引物的PCR產物測序，發現兩個自交系在各個位點存在不同重復基序的差異，并與PAGE凝膠電泳圖展現很高的匹配度(圖2)。

表1 闊短被形M512和狹長被形DP23主要表型差異Table 1 Major phenotypic differences between M512 and DP23

注：*.每組數據由均值及其變化幅度(括號內數字)組成；字母a，b表示M512和DP23在該指標均值存在顯著差異(P<0.05)。

Note:*.Each data consist of mean value and range (data in the bracket)，a，b indicate significant difference in mean value (P<0.05).

電泳圖中每對引物包含2個重復PCR的產物，序列比對結果中第3列為目標序列在NCBI網站中Blast所得的高相似度序列 Each pair of primers inelectrophoretogram contains two duplicated PCR fragments.The third column in the alignment map is the best identified DNA sequence obtained by NCBI blast

圖2 部分多態性引物的PCR產物電泳圖和測序比對結果
Fig.2 PCR products of some polymorphic primers and blast results

2.3 差異條帶序列信息的比對與分析

測序數據顯示，26個多態性EST-SSR位點對應的條帶大小為150～405 bp，共含有8種重復基序，包含二核苷酸5種，三核苷酸3種，其中TC種類比率最大，占31%(表2)。將26對多態性引物擴增產物測序后，在NCBI網站中Blast，其中21對得到相似度高(Ident=75%～99%)、功能已有驗證的基因或蛋白，剩余5對引物D67、J41、J43、V34和V35則未能搜索得到具有高相似度的功能基因。

M512和DP23的表型差異主要集中在花被片形狀、花托形狀和花柄粗度等特征，在DNA水平，兩者展現更豐富的區別。在兩者已明確功能的21個多態性位點中，包含轉錄因子、酶類、蛋白復合體組分甚至RNA等類型，主要涉及植物器官發生發育(D70、E82、F03、K52、L01、L04)、植物激素合成和各種信號傳導(B23、E82、T23、V28)、基礎代謝和逆境調節(B29、D65、F03、L09)等諸多方面，暗示M512和DP23兩個自交系在基因組上甚至轉錄組上存在差異。

3 討 論

花朵作為觀賞荷花主要的觀賞點，其形態、色澤和氣味等決定了觀賞價值。自20世紀60年起，經過中國、日本、美國及泰越等國家育種者的努力，已培育出大量優良的觀賞荷花品種，包含單瓣、半重瓣、重瓣(重臺)和千瓣等花型，以及粉色、紅色、復色及黃色等[1,54]，即通過改良荷花花朵的形與色提升現代觀賞荷花品種的觀賞性。然而，隨著現代社會越來越追求個性化、多元化，人工定向選育具有獨特性、新穎性的觀賞荷花品種已成為市場重要需求之一[4]。本研究中的美洲蓮M512和DP23為定向培育類似極端瓣形月季和菊花的觀賞荷花品種提供了合適的親本材料：其一，兩者被形分別呈現不同于多數美洲蓮的闊短和狹長；其二，兩者花色為其獨有的黃色(圖1)，即M512和DP23同時具備形、色兩個重要觀賞性狀。同時，在20個重要形態指標中，兩者差異主要表現在花朵器官上(表1)，被形(寬長比)即為其中之一。那么，在細胞水平以及分子水平，闊短被形M512和狹長被形DP23是否存在不同，其中調控被形發生發育的過程是什么？解釋這些問題有助理解荷花花朵發育尤其是被形的形態建成的過程，以便后續開發和利用植物被形調控技術與方法。

針對植物特定性狀分子水平的研究，可采用全基因組重測序、轉錄組分析以及構建遺傳圖譜進行QTL定位等技術與方法。M512和DP23為野生型美洲蓮的兩棵實生苗，而美洲蓮一直以野生態存在，遺傳變異小[2,55]，因此，在展開DNA和mRNA水平研究前，利用分子標記粗略評估兩者之間的遺傳差異是必要的。對M512和DP23進行EST-SSR標記篩選，217對引物中26對呈現條帶大小多態性，涉及多個代謝途徑(表2)。事實上，這26個由電泳條帶可視差異篩選而來的差異位點屬于一種InDel變異，而SNP變異因為無法通過電泳條帶反映，所以，M512和DP23基因組之間的真實差異位點應多于26個。同時，由于EST-SSR自身設計的特點，上述多態位點的差異也暗示了一定程度上的轉錄組水平的不同。因此，基于上述數據，本研究認為，下一步應在M512和DP23之間進行被形QTL定位、全基因組重測序和轉錄組分析等深度探究。