參苓白術散對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細胞、Kupffer細胞5-LO/LTB4通路的影響

徐擁建 馮高飛 張云城 黃裕華 鄧遠軍

〔摘要〕 目的 基于5-脂氧化酶（5-lipoxygenase，5-LO）/白三稀B4（leukotrienes B4，LTB4）通路探討參苓白術散對非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）大鼠肝細胞、庫普弗（Kupffer）細胞作用機制。方法 通過Ⅳ型膠原酶離體循環灌注法分離SD大鼠肝細胞及Kupffer細胞，利用油紅O染色觀察肝組織脂滴蓄積情況;ELISA法檢測肝組織LTB4含量;RT-PCR法、Western blot法檢測大鼠肝細胞及Kupffer細胞5-LO、白三烯B4受體（LTB4 receptor type 1，BLT1）mRNA及蛋白表達水平。結果 高脂飲食8周能誘導大鼠NAFLD表現，建模成功。與模型組比較，2個藥物劑量干預組大鼠肝組織LTB4含量均顯著下降（P<0.01）;肝細胞、Kupffer細胞中的 5-LO、BLT1 mRNA及其蛋白表達水平均亦有不同程度的下調（P<0.01）。2個劑量組間比較，以高劑量參苓白術散組效果較為顯著（P<0.05或P<0.01）。結論 參苓白術散可能通過抑制NAFLD大鼠肝細胞、Kupffer細胞5-LO/LTB4通路的激活，減輕肝臟脂質蓄積，發揮防治NAFLD的作用。

〔關鍵詞〕 參苓白術散;肝細胞;Kupffer細胞;5-脂氧化酶;白三稀B4

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.03.009

〔Abstract〕 Objective To investigate the action mechanism of Shenqi Baizhu Powder （SBP） on hepatocytes and Kupffer cells of nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD） rats based on 5-lipoxygenase （5-LO） / leukotrienes B4 （LTB4） pathways. Methods SD rat hepatocytes and Kupffer cells were isolated by in vitro perfusion of type IV collagenase. The hepatic lipid accumulation of liver tissue was detected by oil red O staining. The content of LTB4 in liver tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent ELISA. The mRNA and proteins expression of 5-LO and LTB4 receptor type 1 （BLT1） in were detected by RT-PCR and Western blot. Results It was observed that the rats of NAFLD model were induced by high-fat-diet with 8 weeks successfully. Compared with the model group， the content of LTB4 were decreased significantly in in the two drug intervention groups （P<0.01）， as well as the lower expression levels of gene and proteins expression of 5-LO and BLT1 in hepatocytes and Kupffer cells for the varying degrees （P<0.01）. Compared between two dose groups， the high-dose SBP group showed more significant effects （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion SBP may play a role in preventing and treating NAFLD by inhibiting the activation of 5-LO/LTB4 pathway in liver cells and Kupffer cells of NAFLD rats， and reducing liver lipid accumulation.

〔Keywords〕 Shenling Baizhu Powder; hepatocyte; Kupffer cells; 5-LO; LTB4

近年來，隨著生活水平的提高，飲食結構的變化，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）發病率呈上升趨勢，發病年齡也日趨年輕化，已成為我國第一大慢性肝病以及健康普查發現肝臟轉氨酶異常的首要病因[1-4]。NAFLD發病機制復雜，現代醫學缺乏有效的藥物治療。我們前期研究發現參苓白術散具有顯著的降低血脂，緩解肝臟炎癥，防治NAFLD肝療效確切，可能在NFALD終末防治效應方面發揮多環節、多路徑、多靶點的整合治療作用[5]。白三稀B4（leukotrienes B4，LTB4）作為一種經典的促炎脂質中介，必須在5-脂氧化酶（5-lipoxygenase，5-LO）催化后，經兩個G藕聯蛋白受體-白三烯B4受體（LTB4 receptor type 1， BLT1）和BLT2表達高廣譜和高應答的致炎效應[6]。研究表明，5-LO、LTB4和BLT-1在代謝綜合征如肥胖、胰島素抵抗等相關疾病中介導了慢性系統性低度炎癥的觸發和放大過程[7]。本研究是在前期研究基礎上的進一步探索，通過高脂飼料誘導建立NAFLD大鼠模型，旨在從肝細胞、Kupffer細胞水平，探討參苓白術散對NAFLD大鼠5-LO、LTB4、BLT1的影響，以闡釋其部分干預作用機制。

1 材料

1.1 ?藥物

參苓白術散（人參15 g，白術15 g，茯苓15 g，薏苡仁9 g，砂仁6 g，山藥15 g，桔梗6 g，白扁12 g，蓮子9 g，炙甘草9 g）為中藥配方顆粒劑，方藥組成及飲片劑量均參照《方劑學》教材[8]，由深圳三九醫藥股份有限公司生產，購自廣州暨南大學附屬第一醫院藥房。按免煎中藥包裝說明（如：人參1袋相當于人參飲片3 g），換算成1劑參苓白術散飲片的實際劑量，溶于水，調勻制成混懸液備用。

1.2 ?動物

取8周齡健康成年雄性SD大鼠（SPF級）80只，體質量（200±20） g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物合格證號37009200012268，動物許可證號SCXK（魯）20140007，飼養于暨南大學動物實驗中心，飼養環境合格證號：SYXK（粵）2017-0174。隨機分為4組，每組20只。

1.3 ?主要試劑與抗體

大鼠LTB4酶聯接免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（GD-DS1584）來自上海古朵生物科技有限公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）來自美國Abbkine公司;實時熒光定量PCR試劑盒（RR047A）來自日本Takara公司;兔抗大鼠Anti-Lysozyme（MA5-32154）、Ⅳ型膠原酶（17104-019）均來自ThermoFisher公司;Anti-5-LO抗體（50-244）、Anti-BLT-1抗體（70-465）均來自美國Prosci公司。

1.4 ?主要儀器

Epoch型酶聯免疫檢測儀（美國BioTeK公司）;ELITE ESP型流式細胞檢測儀（美國BECKMAN-COULTER公司）;CFX 96 Touch Deep Well Real-Time PCR儀（美國Bio-rad公司）;Trans-Blot Turbo型轉膜儀（美國Bio-rad公司）。

2 方法

2.1 ?動物分組及造模

按隨機數字表法將大鼠分成4組，每組20只。分別為：正常組、模型組、參苓白術散低劑量組（10 g/kg）及高劑量組（30 g/kg）。參照我們前期研究[9]采用高脂飼料（基礎飼料88%，食用豬油10%，3號膽鹽0.5%，膽固醇1.5%）喂養8周建立NAFLD模型。除正常組大鼠以基礎飼料喂養，其他各組均以高脂飼料喂養。按10 mL/（kg·d）標準，各組大鼠灌服相應劑量的中藥制劑或實驗動物飲用水，給藥劑量按人和動物體表面積折算[10]。每日1次，分籠飼養于18～22 ℃明暗各12 h的SPF級動物實驗室內，連續8周。我們在前期研究[9]中確立了低劑量藥物組為人臨床等效劑量，高劑量藥物組為3倍人臨床等效劑量。

2.2 ?標本采集

2.2.1 ?肝組織、血清標本采集 ?于實驗第8周（均禁食不禁水于末次給藥12 h后）各組隨機選取10只大鼠麻醉后，經腹主動脈采血后處死，取相同部位肝臟若干保存備用。

2.2.2 ?肝細胞、Kupffer細胞的分離和鑒定 ?我們前期研究已熟練掌握離體循環灌注Ⅳ型膠原酶法提取分離大鼠原代肝細胞、Kupffer細胞，提取的肝細胞、Kupffer細胞純度均在達到90%以上，完全滿足相關實驗要求[5，9]。

2.3 ?指標檢測

2.3.1 ?油紅O染色后顯微鏡觀察肝組織形態 ?肝組織經冰凍切片，厚約6～8 μm，行油紅O染色，甘油封片，光鏡下觀察肝組織內脂滴分布及病理組織學變化。

2.3.2 ?ELISA法檢測肝組織LTB4 ?按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠肝組織勻漿LTB4含量。

2.3.3 ?RT-PCR法檢測肝細胞、Kupffer細胞5-LO、BLT1 mRNA相對表達量 ?取培養的貼壁細胞，經4 ℃，10 000 r/min，離心10 min。棄去上清液，加入1 mL TRizol裂解Kupffer細胞，提取總RNA，用微量核酸分光光度計檢測總RNA濃度，按照試劑盒說明，逆轉錄為cDNA。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設計及合成，選用GAPDH為內參基因。5-LO：正向引物：5'-GTAACTTGAGACGCCAGTGTAG-3'，反向引物：5'-AAGCTATACGCTGTCTGGTGGA-3'，片段長度：126 bp;BLT1：正向引物：5'-CTTGGCTGCAAACACTGCGGTCTGG-3'，反向引物：5'-CTGCAGAATGCTTGACACTACAG-3'，片段長度：96 bp;GAPDH：正向引物5'-TGCACCGATCCGGATCATTG-3'，反向引物：5' GATGCAGTATGCCATTCGC-3'，片段長度：128 bp。依照說明書在冰臺上配制20 μL反應液，反應條件為90 ℃持續2 min預變性;95 ℃持續15 s變性;5-LO、BLT1、GAPDH 60 ℃退火20 s;60 ℃延伸1 min，擴增40個循環;再于95 ℃，持續15 s，分析溶解曲線。用Opticon Monitor 3.1軟件整理和分析。設定正常組基因表達水平為1。以2-△△Ct為實驗項目的基因表達相對于正常組的變化倍數，計算各組大鼠肝細胞、Kupffer細胞5-LO、BLT1 mRNA的相對表達量。

2.3.4 ?Western blot法印跡法檢測大鼠肝細胞、Kupffer細胞5-LO、BLT1蛋白表達 ?每RIPA裂解液（含PMSF）1 mL加入5×106個細胞，待充分裂解后，14 000 r/min，4 ℃下離心5 min;為避免蛋白降解，在冰臺上操作收集上清液。BCA法測定蛋白濃度，對樣品上樣量的終濃度調整為40～80 μg。采用SDS-PAGE法電泳分離蛋白，濕轉膜法將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜后，加入含5%脫脂奶粉封閉液，常溫下平搖1h，PBS沖洗液洗膜后，加入提前配制好的一抗稀釋液（5-LO 1∶1 000稀釋;BLT1 11∶1 000稀釋），4 ℃過夜孵育后，再次洗膜除去過量的一抗稀釋液，加二抗稀釋液（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜后，進行化學發光反應。用Quantity One軟件分析目的蛋白與內參的灰度值，并將其比值作為蛋白的表達值進行統計分析。

2.4 ?統計分析

采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用“x±s”表示，多組數據間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），檢驗水準P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 ?肝細胞、Kupffer細胞的純度鑒定

CK-18抗體檢測肝細胞純度為94.57%，Lysozyme抗體檢測Kupffer細胞純度為92.31%。見圖1。

3.2 ?肝組織病理學觀察

模型組肝細胞腫脹，核質深藍染色、靠邊，胞漿可見大片的紅色脂滴，小葉結構破壞，肝索紊亂;正常組肝細胞排列整齊，胞核淡藍居中，結構正常，胞漿偶見正常散在的紅染脂滴;各藥物干預組肝組織染色脂滴紅染面積及程度較模型組明顯縮小和減輕，參苓白術散高劑量組肝臟組織形態最接近于正常組。見圖2。

3.3 ?各組大鼠肝組織LTB4含量比較

模型組大鼠肝組織LTB4含量較正常組顯著升高（P<0.01）;各藥物干預組LTB4含量與模型組比較，顯著降低（P<0.01），其中參苓白術散組高劑量與低劑量組間比較差異有統計學意義（P<0.01）。見表1。

3.4 ?各組大鼠肝細胞、Kupffer細胞5-LO、BLT1

mRNA相對表達量

與模型組比較，各藥物干預組大鼠肝細胞、Kupffer細胞中的5-LO、BLT1 mRNA 相對表達量顯著下降（P<0.01）。參苓白術散高劑量組與低劑量組比較，大鼠肝細胞、Kupffer細胞中的5-LO、BLT1 mRNA相對表達量下降（P<0.05，P<0.01）。見表2-3。

3.5 ?各組大鼠肝細胞、Kupffer細胞5-LO、BLT1蛋白表達

與模型組比較，各藥物干預組大鼠肝細胞、Kupffer細胞中的5-LO、BLT1蛋白表達水平顯著下降（P<0.01）。參苓白術散高劑量組與低劑量組比較，大鼠肝細胞、Kupffer細胞5-LO、BLT1蛋白表達水平下降（P<0.05，P<0.01）。見表4-5，圖3-4。

4 討論

NAFLD是指除外酒精和其他明確的肝損傷致病因素，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪性樣變為主要特征的一組臨床病理綜合征，包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及由其引起的肝纖維化、肝硬化。目前，研究者認為其發生發展可能與脂質代謝障礙、胰島素抵抗，攝入過量果糖，脂肪組織功能紊亂，腸道菌群失調導致炎癥、氧化應激、內質網應激有關[11]。但其確切的發病機制尚未明確。時至今日，現代醫學尚無治療NAFLD的特效藥物，對其治療多以病因治療為主，如改變生活方式、控制體重及治療原發病如高血脂癥、2型糖尿病，常常選用胰島素增敏劑如二甲雙胍、羅格列酮、吡格列酮及他汀類調脂藥物如阿托伐他汀、普伐他汀等，因有一定的肝毒性，無法長期口服及維持治療。祖國醫學沒有脂肪肝這一病名，脂肪肝大致屬于“脅痛”“肝著”“肝癖”等病范疇。關于病因病機、治則治法的論述，現代醫家認為肝體用失調、脾腎虧虛為其主要特點，痰、濕、濁、瘀、熱是其主要病理因素，疾病初期主要治以疏肝理氣、健脾和胃;中后期以健脾益腎、化瘀散結為主[12]。可見健脾法，貫穿了治療NAFLD的始終。參苓白術散出自北宋《太平惠民和劑局方》，具有健脾益氣、滲濕止泄的功效。Meta分析表明[13]，參苓白術散治療NAFLD存在其優勢。筆者前期研究也證實參苓白術散具有顯著的降低血脂，緩解肝臟炎癥，防治脂肪肝療效確切[9]。本次實驗是對參苓白術散防治NAFLD作用機制的進一步探索。

肝臟的脂肪蓄積主要發生在肝細胞，而位于肝血竇內的肝臟Kupffer細胞是人體內最大的固定巨噬細胞群，約占肝臟所有細胞總數的15%，具有吞噬微生物、清除內毒素，攝取抗原并激發獲得性免疫、釋放炎性因子，促發肝臟炎癥反應的作用[14-15]。白三烯（leukotrienes，LTs）是目前已知在炎癥損傷中活性最強的趨化因子，在介導炎性細胞的黏附、浸潤以及促炎因子的釋放過程中發揮著重要的作用[16]。5-LO是催化花生四烯酸轉化成LTs的關鍵酶介[17]。

LTB4作為5-LO合成的主要產物，主要在肝組織中充分表達。研究發現，在高脂飲食的小鼠肝臟和肌肉組織中LTB4表達顯著增加，其增加可促進炎癥因子，介導炎癥反應，是組織炎癥浸潤的一個關鍵中介[18-19]。當機體出現脂質代謝紊亂后，5-LO常在炎癥激活的巨噬細胞、肥大細胞、樹突狀細胞中大量表達，在單核細胞轉化為組織細胞的過程中，5-LO表達上調，但在非炎性階段，其含量無明顯變化。研究表明，抑制5-LO的表達能促使Kupffer細胞程序性凋亡，從而減輕小鼠肝損傷[20]。因此通過減少5-LO的表達，對抑制肝臟疾病的發病及進展，可能起到治療作用[21]。在高脂飼料誘導的非酒精性脂肪性肝炎大鼠中，肝組織LTB4分泌增加，其催化酶5-LOmRNA及蛋白表達水平顯著上調，其受體BLT1亦上調，表明肝臟脂肪變程度及炎癥損傷的進展程度與肝內5-LO、BLT1的表達呈正相關[22-23]。可見，肝內5-LO、LTB4、BLT1的表達水平，與肝脂肪變的嚴重程度呈正相關。本次實驗擬通過肝細胞、Kupffer細胞視角，探討參苓白術散對NAFLD大鼠5-LO/LTB4通路的影響。

本實驗病理學結果表明，高脂飼料喂養8周建立大鼠NAFLD模型存在顯著的脂質代謝紊亂，參苓白術散可不同程度地降低NAFLD大鼠肝組織LTB4含量，下調肝細胞、Kupffer細胞5-LO、BLT1 mRNA及蛋白表達水平，以高劑量參苓白術散組作用最為顯著。參苓白術散在改善肝臟脂肪沉積，可能與劑量有一定的相關性;初步揭示參苓白術散可能是通過抑制NAFLD大鼠5-LO/LTB4通路激活，發揮抗NAFLD的藥理作用。當然，參苓白術散對NAFLD的防治也可能是多方面、多層次、多環節、不同藥理作用的結果，因此有必要對參苓白術散防治NAFLD的具體機制進行進一步的研究和探討。

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