基于線粒體D-loop的西江流域粗唇鮠群體遺傳多樣性分析

彭 敏，韓耀全，吳偉軍，李育森，施 軍，王大鵬，雷建軍，何安尤

(廣西水產科學研究院，廣西壯族自治區遺傳育種及健康養殖重點實驗室，南寧 530021)

粗唇鮠(Leiocassiscrassilabris)隸屬鲇形目(Siluriformes)鲿科(Bagridae)鮠屬(Leiocassis)，常棲息于江河、湖泊的底層草叢和巖洞內，為底棲肉食性小型經濟魚類，白天極少活動，夜間外出覓食，以底棲生物，小魚和小蝦為食。在中國廣泛分布于長江、珠江、閩江等水系。因其肉質細嫩，味道鮮美，無肌間刺，食用價值較高而深受消費者喜愛。近年調查發現西江主要干支流，粗唇鮠的捕獲量有明顯下降趨勢。粗唇鮠資源量的降低，預示著有效繁殖群體變小，這有可能造成性別失衡、遺傳漂變、遺傳多樣性丟失等現象。陳鋒等[1]在2013年對珠江龍灘庫尾至長洲壩下江段干支流魚類調查中發現，由于生境的改變，河口型魚類分布范圍變窄、珍稀瀕危特有魚類種群規模變小、流水性魚類資源量顯著下降；徐田振等[2]在2012-2013年在郁江金陵江段開展了漂流性魚卵的調查監測發現，與歷史資料相比，郁江魚類產卵場功能發生較大變化，部分魚類產卵場消失，部分魚類雖然還能自然補充，但資源量較小。表明河流生境的變化及現行的過度捕撈等因素對魚類群落結構及早期資源的補充會造成很大的影響。

線粒體DNA因具有母系遺傳、進化速度快等特點，常被用于研究群體親緣關系。粗唇鮠線粒體全基因組包括13個蛋白質編碼基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因和1個非編碼區(D-loop)[3]，其中D-loop更是魚類群體遺傳學研究的常用材料。如李珊[4]對清水江的斑鱖(Sinipercascherzeri)種群遺傳分析發現其遺傳變異程度不高，遺傳多樣性豐富，種群結構穩定；侯新遠等[5]對我國5種蝦虎魚類進行系統進化關系分析，描繪其親源關系的遠近；董微微等[6]對長江流域異鰾鰍鮀(Xenophysogobioboulengeri)的遺傳分析，推測其種群擴張時間大概為0.017 3 Ma，均采用線粒體DNA的D-loop序列作為研究對象。劉偉等[7]亦曾使用D-loop序列對貴州都柳江段的粗唇鮠群體種群遺傳多樣性進行了相關研究，然而廣度較小。粗唇鮠作為西江流域廣西境內江段的重要經濟魚類之一，在廣西各江段群體中遺傳多樣性如何，是否發生遺傳漂變迄今未見報道，這對廣西境內粗唇鮠的種質資源監測及保護理論的構建是有所欠缺的。本研究通過對西江流域廣西境內7條江段的粗唇鮠群體分別進行mtDNA D-loop 序列測定，旨在了解其遺傳結構，分析其不同江段群體的遺傳分化程度和基因交流情況，為西江水系粗唇鮠自然種群的合理開發利用提供參考，為粗唇鮠種質資源恢復與可持續利用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗用粗唇鮠樣本共227尾，于2014年6月至2016年12月，分別采自西江流域7段支流或干流，其中都柳江(DLJ)廣西段(S1)31尾，紅水河(HSH)江段(S2)30尾，柳江(LIUJ)段(S3)50尾，西江(XIJ)段(S4)29尾，右江(YOUJ)段(S5)30尾，郁江(YUJ)段(S6)27尾，左江(ZJ)段(S7)30尾(圖1)。材料取自新鮮個體背部肌肉，每尾5 g，分別用95%酒精保存備用，前兩天每天更換酒精一次。

圖1 粗唇鮠采樣點Fig.1 Sampling site of L.crassilabris

1.2 DNA提取、PCR擴增與測序

粗唇鮠的總DNA采用醋酸銨法提取[8]，采用微量核酸蛋白分析儀測量DNA濃度和純度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，經檢測合格的DNA模板保存于-20 ℃冰箱備用。

粗唇鮠的D-loop序列擴增采用上海生工生物工程技術服務有限公司合成的D-loop通用引物，序列為D-loop-F(5′-ACC CCT GGC TCC CAA AGC-3′)和D-loop-R(5′-ATC TTA GCA TCT TCA GTG-3′)[9]。

PCR反應體系50.0 μL，包括2×Ex Taq Bufffer 25 μL，10 μmol/L的上、下游引物各2 μL，100 ng/μL DNA模板2.0 μL，用ddH2O補至50.0 μL。退火溫度為54.0 ℃。經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的PCR擴增產物由深圳華大基因公司正向測序。

1.3 數據處理

測序所得序列采用clustalw軟件并輔以人工校對調整，堿基含量及變異位點采用MEGA 4.1軟件分析，計算Kimura 2-parameter遺傳距離，并以長吻鮠(GenBank登錄號：GU596454.1)為外類群構建單倍型的NJ系統樹。利用DnsSP 5.10軟件統計單倍型及計算遺傳多樣性參數。采用Arlequin軟件進行分子方差分析，評估種群的遺傳分化程度，采用Tajima’s D和Fu′s Fs中性檢驗估測有效種群大小的歷史。

2 結果與分析

2.1 mtDNA D-loop堿基組成

獲得的粗唇鮠D-loop序列長度均為666 bp，堿基T、C、A、G的平均含量為32.9%、23.3%、29.4%、14.4%，其中A+T(62.3%)明顯高于C+G(37.7%)，表現出較強的堿基偏倚性，與一般脊椎動物線粒體DNA序列特征相一致。

2.2 遺傳多樣性分析

粗唇鮠D-loop序列均未檢測到插入或缺失位點，檢測到變異位點6個，占總位點數的0.90%，其中簡約信息位點2個，單一變異位點4個；DLJ、LIUJ、YUJ、ZJ4個群體未發現變異位點，HSH江段1個，YOUJ段2個，XIJ段5個。轉顛換比值R趨于無窮大，說明此基因序列突變未達到飽和狀態，受進化噪音的影響可能性較小(表1)。在DAMBE進行DNA序列替換飽和性檢驗中，Iss=0.004 2，Iss.c=0.774 8，Iss

7個江段的粗唇鮠無論是單倍型多樣性指數和核苷酸多樣性指數均表現出較低的整體特征。整體單倍型多樣性指數為0.052 24，核苷酸多樣性指數為0.000 11。其中，單倍型多樣性指數與核苷酸多樣性指數均為XIJ群體最高，分別為0.199 51、0.000 52；DLJ、LIUJ、YUJ和ZJ群體最低，均為0.000 00。平均核苷酸差異最大為XIJ，為0.344 83，其次為YOUJ，為0.133 33(表1)。

227尾個體共檢測出6種單倍型，即hap1～hap6，其中hap1為優勢單倍型，在所有群體均有出現，占總個體數的97.36%；hap3僅存在于XIJ與YOUJ群體；有4種單倍型為不同江段群體獨享，其中hap2為HSH獨享，hap4、hap5為XIJ獨享，hap6為YOUJ獨享(圖2)。

表1 粗唇鮠7個群體遺傳多樣性指數Tab.1 Genetic diversity index among seven populations of L.crassilabris

圖2 粗唇鮠NJ單倍型系統樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of L.crassilabris

2.3 粗唇鮠群體遺傳分化

2.3.1 種群遺傳距離

MEGA4.1軟件分析測序結果表明，粗唇鮠群體內的遺傳距離在0.000 00～0.000 52之間。其中XIJ群體內的遺傳距離最遠為0.000 52；其次為YOUJ，為0.000 20；HSH為0.000 10；而其余4個江段群體內的遺傳距離均為0.000 00。各群體間的遺傳距離在0.000 00～0.000 36之間，XIJ與其他幾個江段群體間的距離均較遠，與YOUJ最遠為0.000 36，其次與HSH群體，為0.000 31，與YUJ、ZJ、LIUJ、都LIUJ群體間的遺傳距離均為0.000 26(表2)。

2.3.2 種群遺傳分化系數

7個江段粗唇鮠群體之間的遺傳分化系數在-0.010 62～0.019 77之間，XIJ與LIUJ群體的遺傳分化系數最大，為0.01977；其次為LIUJ與HSH/YOUJ群體的遺傳分化系數均為0.017 84；而HSH與XIJ/YUJ群體之間，XIJ與YOUJ/YUJ群體之間，YOUJ與YUJ群體之間的遺傳分化程度小且為負值。

群體間和群體內的分子變異分析結果顯示，群體間的遺傳分化系數Fst=0.001 30；而且變異幾乎均來自群體內部，群體間的變異占0.13%,群體內占99.87% ，整個調查群體基因流Nm=384.1154(表2、表3)。

表2 粗唇鮠群體遺傳距離與FstTab.2 Genetic distance and genetic differentiation coefficient Fst of L.crassilabris

注：對角線為群體內遺傳距離，對角線上方為遺傳分化系數Fst，對角線下方為群體間遺傳距離。

表3 粗唇鮠群體間和群體內的分子變異分析(AMOVA)Tab.3 Analysis of interspecific and intraspecific molecular variation of L.crassilabris(AMOVA)

2.4 群體動態分析

無限突變位點模型的中性檢驗值Fu’s Fs 檢驗結果表明，Tajima’s D(-1.857 04,0.000 00,P<0.01)、Fu′s Fs(-9.875 96,0.000 00,P<0.01)均為顯著負值，同時核苷酸錯配分布結果顯示，粗唇鮠種群單倍型和堿基差異呈單峰分布，表明粗唇鮠種群近期經歷過種群擴張事件(圖3)。

根據公式τ=2ut計算XIJ水系粗唇鮠種群的大約擴張時間，參照鲿科魚類的線粒體DNA進化速率約為0.18%～0.30%/Ma[10]，而粗唇鮠性成熟最早為2齡，通過AMOVA分析表明τ=3.000，因此推測本次調查的粗唇鮠群體基于D-loop基因序列的擴張時間可能是在距今0.75～1.25 Ma前。

圖3 粗唇鮠核苷酸錯配分布圖Fig.3 Mismatch distribution of L.crassilabris

3 討論

3.1 粗唇鮠的遺傳多樣性

3.1.1 D-loop結構與變異性

7個江段的粗唇鮠D-loop序列長度均為666 bp，表現出較強的堿基偏倚性，與一般脊椎動物線粒體DNA序列特征相一致。堿基轉顛換比值R趨于無窮大，說明此基因序列突變未達到飽和狀態，受進化噪音的影響可能性較小，Wolstenhome等[11]認為，轉顛換的偏倚性可能與序列間的差異存在著一定的相關性，即轉顛換的比率與物種從共同祖先進化的時間成反比，由此可以推斷XIJ流域的粗唇鮠有效種群是在近期由單一、少數的種群建立的。

3.1.2 遺傳多樣性指數分析

單倍型多樣性指數Hd和核苷酸多樣性指數π是評估遺傳多樣性的兩個重要參數[12]。本研究中7個江段群體中，XIJ群體單倍型多樣性指數與核苷酸多樣性指數均為最高，平均核苷酸差異最大，LIUJ、LIUJ、YUJ和ZJ群體各多樣性指數最低，核苷酸差異最小，整體呈現下游高于上游，南方高于北方的現象。這與白曉慧等[13]對天津5個大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)自然群體的研究結果較為一致。粗唇鮠整體單倍型多樣性指數為0.052 24，核苷酸多樣性指數為0.000 11，遠低于珠江水系的其他魚類，如底棲肉食性魚類黃顙魚(Pelteobagrusfulvidrac)群體(Hd=0.721～0.911，π=0.002 2～0.046 89)[14]、中上層雜食性魚類赤眼鱒(SpualiobarbusCurriculus)群體(Hd=0.700 0～1.000 0，π=0.011 3～0.013 7)[15]、中下層雜食性魚類鯪(Cirrhinamolitorella)群體(Hd=0.826，π=0.003 32)[16]和中下層肉食性魚類鱖魚(Hd=0.773，π=0.001 95)[17]。程丹汝等[18]在研究銅陵順安河中不同種類魚體內磺胺類抗生素累積中發現，在7種不同的魚類中，7種磺胺類抗生素的濃度水平在粗唇鮠體內含量最高；Li等[19]亦曾報道肉食性、底棲性魚類在大壩蓄水后汞的生物累積高于其他魚類。這在一定程度上可推測底棲肉食性魚類的粗唇鮠相比于其他魚類可能更容易受環境污染的影響，因此推斷環境污染可能是粗唇鮠資源量下降，遺傳多樣性丟失的其中一個原因。一個物種遺傳多樣性的高低與其適應能力、生存能力和進化潛力密切相關。遺傳多樣性為物種的適應能力、生存能力和進化能力提供了潛在的遺傳基礎和儲備。物種遺傳多樣性越豐富，其適應能力、生存能力和進化潛力越大；遺傳多樣性的降低可導致其適應能力和生存能力降低、物種退化甚至威脅物種生存[20]。本次調查的粗唇鮠群體單倍型多樣性指數與核苷酸多樣性指數遠低于DLJ易危物種小口白甲魚(Hd=0.260，π=0.005 75)[21]，說明粗唇鮠種群的保護與恢復應受到重視。

3.2 粗唇鮠的遺傳變異分析

單倍型之間的遺傳距離是衡量一個物種或群體的mtDNA變異程度的重要指標，遺傳距離越大表明群體間親緣關系越遠[22]。本次調查粗唇鮠群體內的遺傳距離在0.000 00～0.000 52之間，遠遠未達到種群劃分的界限，表明調查的7個江段粗唇鮠群體具有較近的親緣關系，無明顯的種群分化，可能是處于同一水系的粗唇鮠群體有遷移習性形成基因交流所致。與熊美華等[23]對長江向家壩上、下圓口銅魚(Coreiusguichenoti)群體的遺傳分化調查結果相似，表明大壩并不能阻礙所有魚類的基因交流。

Wright按照遺傳分化指數的大小提出了遺傳分化標準(Fst<0.05，無遺傳分化；0.05< Fst <0.15，較小遺傳分化；0.150.25，遺傳分化較大)[24]。本研究中7個江段粗唇鮠群體間的遺傳分化系數在-0.010 62～0.019 77之間，再次證明群體間無遺傳分化。同時基因流 Nm=384.115 4，表明群體間基因交流非常充分，是一個隨機交配群體[25]，群體間基本不存在隔離和分化，應當被當做一個種群來進行開發利用。

NJ鄰接樹和單倍型網絡圖顯示，粗唇鮠群體間不存在明顯的地理結構和譜系結構，另外，通過AMOVA分析發現7個江段群體的遺傳變異系數Fst=0.001 30，群體間變異占0.13%，群體內變異占99.87%，變異幾乎全部來自種群內部?？赡苁荴IJ流域粗唇鮠種群最近發生過種群的瓶頸效應或由單一、少數種群所產生的奠基者效應。

3.3 粗唇鮠的種群動態

Tajima’s D與Fu’s Fs值中性檢驗常用于推測種群歷史發生，如果Tajima’s D與Fu’s Fs值呈負值，且在統計學上達到顯著標準，則說明序列中含有比中性進化模型更多的核苷酸位點變化，可能預示著被研究種群曾經經歷過一個擴張的歷史[26]。中性檢測結果表明，Tajima’s D、Fu’s Fs均為顯著負值，同時核苷酸錯配分布結果呈單峰，故認為粗唇鮠種群最近經歷過種群擴張事件，擴張時間推測在距今0.75～1.25 Ma，與采用相同進化速率推算出的鲇形目鲿科的黃顙魚(0.41～0.69 Ma年前)、光澤黃顙魚[27](0.51～0.86 Ma年前)擴張時間相近。

3.4 保護建議

研究結果表明，本次調查江段的粗唇鮠群體遺傳多樣性水平較低，預示著其群體對復雜環境具有更差的適應能力。因此，應通過合理限制捕撈規格，加強禁漁期監管，維持其野生資源的可持續性開發與利用；同時還可以考慮收集XIJ流域上游，如貴州、云南江段的親魚進行人工繁育，并合理的增殖放流于廣XIJ段以增加其種群多樣性，若有必要還需實行捕撈限額制度或減少釣捕、并放生籠捕所獲得的小規格魚種，以促進粗唇鮠種群的恢復與健康發展。