不同溫度下BDE-209對草魚離體肝臟組織的毒性效應

解華曉，鐘利橋，吳路銀，姚 凡,3，倪朝輝

(1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，農業農村部長江中上游漁業生態環境監測中心，武漢 430223；3.華中農業大學水產學院，武漢 430070)

十溴聯苯醚(BDE-209)是一種廣泛使用的阻燃劑[1]，屬于持久性有機污染物，在環境中很難被降解，且具有生物累積性，并會通過食物鏈損害人體健康[2]。在水、土壤、沉積物、灰塵、鳥類、魚類和哺乳動物等樣品中均能檢測出BDE-209[3-4]， BDE-209的毒性作用包括發育毒性[5-7]、甲狀腺毒性[8,11]、生殖毒性[9-10]等。高濃度BDE-209可以殺死大部分太平洋鱈(Gadusmacrocephalus)精子[12]，暴露于BDE-209的斑馬魚(Daniorerio)親本可以將BDE-209轉移到子代并且可引起子代的發育毒性和甲狀腺內分泌紊亂[13]。BDE-209會對黑頭呆魚(Pimephalespromelas)的肝臟造成肝臟細胞核空泡化[14]。歐盟委員會將BDE-209作為管控物質，并規定2019年3月2日之后，所有物品中BDE-209的質量分數不得超過0.1%[14]。

目前，有關BDE-209的毒性研究集中于特定單一環境條件下對生物的毒理影響。然而在自然條件下，魚類的生殖發育與溫度有很大關系[18]。溫度作為重要的非生物因子不僅影響魚類的生理活動，也對暴露在化學成分中的生物體的毒性反應有很強的響應。因此，有必要對不同溫度下的環境污染物的毒理效應做進一步研究。本研究通過體外染毒的方式探討不同溫度下BDE-209對草魚離體肝臟組織的毒性效應，為BDE-209對水生生物的毒理影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇健康的草魚(Ctenopharyngodonidellus)作為試驗用魚，試驗所用草魚購自仙桃養殖場，其體長為(17.41±0.63)cm，體重為(49.67±4.28)g，試驗開始前試驗魚在水族箱中馴養兩周，每天定時投喂餌料兩次，取樣前禁食一天。

試驗所用BDE-209的純度大于95%(AccuStandard，美國)，二甲亞砜(DMSO)的純度大于99%(國藥集團化學試劑有限公司)，將BDE-209溶于DMSO配成1 mg/mL的母液，再按要求稀釋成所需，避光保存。

試驗所用儀器有超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技公司)、低溫冷凍離心機(centrifuge 5415R，Eppendorf公司)，酶標儀(SYNERGY/2，bioTek公司)、分光光度計(UV-1800PC，biotech 公司)。

1.2 試驗方法

試驗設置15、25、35 ℃三種溫度，每個溫度組BDE-209設置四個濃度梯度，分別為0.00、0.04、4.00、400.00 μg/L，每組設六個重復。草魚肝臟組織勻漿液的制備：取馴養后的健康草魚幼魚約30尾，用紗布擦干其表面后，解剖取其肝臟組織，在4 ℃的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙擦干后對肝臟組織稱重，按1∶9(w/v)的比例加入生理鹽水(4 ℃)，用眼科剪剪碎組織后超聲波勻漿，制成質量分數10%的組織勻漿液。混勻后分裝在72個2 mL EP管中，每管1.5 mL(勻漿液制備及加污染物過程均在冰浴中進行)，加入不同濃度的BDE-209混勻后分別置于15、25、35 ℃的水浴鍋中孵育60 min，然后低溫離心取上清分裝，-80 ℃冰箱中保存，用于各指標的測定。

SOD、CAT、GR以及MDA測定參照試劑盒(購自南京建成生物研究所)說明書進行。

1.3 數據處理

實驗數據采用統計學方法處理。結果以平均值±標準差(mean±SD)的形式來體現，同時用One-Way ANOVA方差分析進一步分析(SPSS 13.0)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 不同溫度下BDE-209對草魚離體肝臟組織SOD活性的影響

低溫時(15 ℃)BDE-209各濃度組與對照組無顯著性差異，常溫時(25 ℃)4.00 μg/L BDE-209染毒的肝臟組織SOD活性與對照組相比顯著性升高；高溫時(35 ℃)0.04 、4.00、400.00 μg/L濃度組與對照組相比SOD活性顯著性降低(圖1)。

圖1 不同溫度下BDE-209對草魚離體肝臟組織SOD活性的影響Fig.1 Effects of BDE-209 on SOD activity in isolated liver tissues of C.idellus at different temperatures數據表示為平均值±標準差(n=6)。下圖同。

2.2 不同溫度下BDE-209對草魚離體肝臟組織CAT活性的影響

低溫時(15 ℃)BDE-209各濃度組CAT活性呈現出先升高后降低的趨勢，但差異性不顯著；常溫時(25 ℃)，0.04 μg/L 濃度組CAT活性與對照組相比極顯著性升高、4.00 μg/L 濃度組CAT活性與對照組相比顯著性降低,400 μg/L組CAT活性比對照組極顯著降低。高溫時(35 ℃)，各濃度組都比對照組CAT活性顯著性降低(圖2)。

圖2 不同溫度下BDE-209對草魚離體肝臟組織CAT活性的影響Fig.2 Effects of BDE-209 on CAT activity in isolated liver tissues of C.idellus at different temperatures

2.3 不同溫度下BDE-209對草魚離體肝臟組織GR活性的影響

低溫時(15 ℃)BDE-209各濃度組GR活性與對照組相比無顯著變化，常溫時(25 ℃)4.00 μg/L BDE-209暴露組GR活性與對照組相比呈顯著性升高，400.00 μg/L BDE-209暴露組GR活性與對照組相比呈顯著性降低，高溫時(35 ℃)各BDE-209暴露組GR活性與對照組相比均呈顯著性降低(圖3)。

圖3 不同溫度下BDE-209對草魚離體肝臟組織GR活性的影響Fig.3 Effects of BDE-209 on GR activity in isolated liver tissues of C.idellus at different temperatures

2.4 不同溫度下BDE-209對草魚離體肝臟組織MDA含量的影響

低溫時(15 ℃)BDE-209濃度為400.00 μg/L時MDA含量顯著升高；常溫時(25 ℃)BDE-209濃度為4.00 μg/L、400.00 μg/L時MDA含量與對照組相比顯著性升高；高溫時(35 ℃)BDE-209濃度為0.04、4.00、400.00 μg/L時MDA含量與對照組相比顯著升高(圖4)。

圖4 不同溫度下BDE-209對草魚離體肝臟組織MDA含量的影響Fig.4 Effects of BDE-209 on the content of MDA in isolated liver tissues of C.idellus at different temperatures

3 討論

3.1 不同溫度下BDE-209對草魚幼魚抗氧化酶的影響

通常情況下，生物體內氧自由基的生成與清除處于動態平衡。如果體內產生的自由基得不到及時有效的清除，就會通過損傷生物大分子破壞細胞的結構和功能，造成氧化損傷[19]，SOD和CAT組成魚體抗氧化系統的第一道防線，對機體的氧化和抗氧化平衡起著非常重要的作用。GR主要是維持組織內還原態谷胱甘肽(GSH)的正常水平[20]，GSH是組織內重要的抗氧化劑，在解毒代謝過程中GSH會被氧化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)，而GR會重新催化GSSG還原為GSH[21]，所以GR在抗氧化體系中起重要作用。SOD、CAT、GR可以消除氧自由基以減少有害物質對機體的損傷[22]。在本研究中，不同濃度的BDE-209在相同的溫度下SOD、CAT、GR活性趨勢變化相似，在低溫(15 ℃)時，BDE-209各濃度組酶活與對照組相比無顯著性差異，在常溫(25 ℃)時，SOD、CAT、GR活性均有先升高后降低的現象，而高溫(35 ℃)處理下，各 BDE-209濃度組酶活性與對照組相比均顯著性降低，白秀娟等[23]通過研究不同溫度條件下文昌魚(Branchiostomabelcheri)對銅離子和鋅離子的耐受性也發現在相同Zn2+條件下，18 ℃時文昌魚存活率最高，超過這個溫度，文昌魚存活率降低，這說明溫度會影響污染物對生物體的毒性作用。Tang等[24]通過研究五溴聯苯醚對大型蚤毒性作用也發現SOD和CAT在低濃度的五溴聯苯醚的作用下有顯著升高現象。Chi等[25]研究了BDE-209對體外培養的人體紅細胞(hRBCs)也發現BDE-209會誘導SOD CAT酶活性升高。這可能是由于在低溫條件下BDE-209引起肝臟組織的氧化應激反應較小，而在常溫和高溫條件下BDE-209對魚體肝臟組織造成了氧化脅迫，使機體產生過多的氧自由基，氧自由基得不到及時有效的清除就會對機體造成氧化損傷，所以在高溫時SOD、CAT、GR活性均受到抑制應該是BDE-209已經對肝臟組織造成氧化損傷。張喆等[26]通過研究BDE-209對菲律賓蛤仔外套膜的氧化損傷也發現SOD和CAT在清除BDE-209脅迫產生的氧自由基過程中發揮重要作用，高濃度的BDE-209會抑制抗氧化酶的活性，這與本實驗研究結果相似。

3.2 不同溫度下BDE-209對草魚幼魚脂質氧化產物MDA的影響

MDA是一種脂質氧化的天然產物，MDA的含量可直接反映機體組織內脂質過氧化程度，間接反映組織細胞損傷的程度[27]。在本研究中同一溫度下，常溫組和高溫組隨著BDE-209濃度的升高MDA含量顯著升高，可見在一定溫度范圍內溫度越高BDE-209對組織細胞的損傷越大，武艷華[28]研究表明汞在高溫狀態下對草魚肝臟細胞造成的損傷更大，這與本實驗結果相符。這表明高濃度的BDE-209會對組織細胞造成嚴重的氧化損傷。Wang等[29]在BDE-209對大鼠甲狀腺的毒性研究中發現BDE-209會造成大鼠甲狀腺的氧化損傷，其MDA含量也有顯著升高現象。