藍鰓太陽魚諾卡氏菌的分離鑒定及藥敏分析

陳 梅，馮 藝，陳文強，區慶淦，陳建酬

(佛山科學技術學院 生命科學與工程學院，廣東佛山 528231)

藍鰓太陽魚(Lepomismacrochirus)屬鱸形目太陽魚科，原產于美國，于1987年首次引進我國[1]。其屬溫水性小體型魚類，肉質鮮美，口感好，無肌間刺，生長適溫范圍廣(1～38 ℃)，食性雜，適應性強，易于養殖，是一種集食用、游釣、觀賞于一體的淡水名貴魚類[2]，具有較大的市場價值。

諾卡氏菌(Nocardia)是介于細菌與真菌間的革蘭氏陽性菌，常將其歸類為細菌，屬于放線菌門諾卡氏菌科諾卡氏菌屬，以腐生為主，是一種人獸共患的慢性傳染病，在水產養殖方面危害極大[3]。魚類諾卡氏菌病的致病菌主要有鰤魚諾卡氏菌(N.seriolae)[4]、星狀諾卡氏菌(N.asteroides)[5]和殺鮭諾卡氏菌(N.salmonicida)[6]。其中，以鰤魚諾卡氏菌為主[7]。鰤魚諾卡氏菌是一種條件致病菌，在魚體免疫力低下時，很容易通過餌料、鰓、傷口感染，主要癥狀是病魚真皮下會形成膿瘡，有干酪狀壞死情況，鰓上有絮狀結節，最明顯是脾臟和腎臟上有大量肉眼可見的白色結節，肝、心和鰾上也可見結節[8]。在已有的報道中，諾卡氏菌對烏鱧(Ophicephalussargus)[9]、加州鱸(Micropterussalmonides)[10]、招財魚(Osphronemusgoramy)[11]、大黃魚[12]等造成了極大的危害，而藍鰓太陽魚的諾卡氏菌病在國內鮮見報道。本研究對患病藍鰓太陽魚內臟進行了病原菌的分離鑒定，并對其生物學特征及致病性進行了相關的研究，旨在為養殖藍鰓太陽魚諾卡氏菌病的防治提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

藍鰓太陽魚病樣采自佛山市順德區某養殖場，體長(15.3±1.1)cm，體質量(80.3±5.5)g。健康藍鰓太陽魚(80.1±5.3)g/尾，購自佛山市某水產養殖場。

試驗用腦心浸液培養基(BHI)、瓊脂粉、細菌微量生化鑒定管均購于廣東環凱微生物有限公司。細菌基因組DNA提取試劑盒及PCR所用的試劑購自北京全式金生物技術有限公司。特異性引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。藥物敏感紙片購自杭州濱和微生物有限公司。

1.2 病原菌分離純化

無菌狀態下，從患病藍鰓太陽魚的肝臟、腎臟和脾臟中挑取黃豆大小的組織塊，輕輕涂抹在BHI培養基上，再劃線分離菌株，25 ℃ 恒溫培養3-7 d。挑取單個優勢菌落在BHI平板上劃線分離純化1～2次，獲得純培養物，接種于BHI肉湯培養基，25 ℃培養3 d后，加入30%無菌甘油，置于-80 ℃保存。

1.3 回歸感染試驗

健康藍鰓太陽魚暫養一周，水溫控制在25 ℃，連續充氣增氧，無異常情況后進行人工感染試驗。90尾健康藍鰓太陽魚分為兩組，每組3個平行，每個平行15尾。將菌株SD1810液體培養3 d，用無菌生理鹽水調整菌液濃度為2.8×107CFU/mL，按照0.2 mL/尾的劑量對藍鰓太陽魚進行腹腔注射；對照組藍鰓太陽魚則按相同的劑量在相同的部位注射無菌生理鹽水。連續觀察40 d，每天正常喂養、充氧、吸污、換水，同時觀察記錄發病癥狀及死亡情況，對患病藍鰓太陽魚重新進行病原菌分離鑒定。

1.4 病原菌生理生化特征

在BHI瓊脂培養基中將菌株SD1810進行平板劃線，25 ℃恒溫培養3～5 d，肉眼觀察菌落形態、大小、顏色等。同時，按常規方法進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察菌體形態。將菌株SD1810接種于BHI肉湯中振蕩(120 r/min)培養3 d后，根據細菌生化鑒定管的說明書進行操作，檢測細菌各項生理生化指標。

1.5 病原菌16S rRNA基因序列測定及系統發育樹分析

將菌株SD1810接種于BHI肉湯振蕩(120 r/min)培養3 d后，1 000 r/min離心收集菌液，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取該菌的總DNA作為PCR反應的模板。采用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′擴增分離菌株SD1810的16 S rRNA基因序列。反應體系為50 μL，包括：mix 25 μL，ddH2O 19 μL，濃度為10 μmol/L的正反向引物各1 μL，菌株總模板DNA 4 μL；反應條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共34個循環，最后72 ℃延伸5 min。PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

將測序得到菌株SD1810的16S rRNA基因序列在NCBI網站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上進行BLAST比對,利用MEGA7.0軟件中的Clustal W模式進行核苷酸序列比對，再用Neighbor-joining法構建分子生物進化樹。

1.6 藥敏試驗

以無菌生理鹽水將菌株SD1810的3 d培養物稀釋成1.7×108CFU/mL的菌懸液，取100 μL菌懸液涂布于BHI瓊脂平板中，采用K-B紙片擴散法，用無菌鑷子將抗生素藥敏紙片輕輕貼在培養基表面，每平板放置3片，25 ℃培養7 d后測量抑菌圈直徑(mm)。

2 結果

2.1 病原菌的形態特征

從脾臟分離獲得的優勢菌株SD1810為革蘭氏陽性分枝桿菌，無運動性。在BHI瓊脂培養基上生長3～5 d可見白色沙粒狀菌落，其單菌落較小、表面干燥，顯微鏡下可觀察到灰黑色菌落，邊緣不整齊(圖1)。接種到BHI液體培養基上靜置培養3 d后，菌液澄清透明，底部有少量白色菌體沉淀。

圖1 菌株SD1810菌落及菌體形態Fig.1 Colony and morphology of strain SD1810a.菌株SD1810菌落形態；b.菌株SD1810顯微鏡下菌落形態；c.菌株SD1810菌體形態

2.2 回歸感染試驗結果

經人工感染發病藍鰓太陽魚15 d后開始死亡，病死魚的主要癥狀與自然發病藍鰓太陽魚癥狀相似，其體表潰爛出血，有膿瘡，鰓絲有少量白色結節(圖2a)。解剖后，肝臟、脾臟、腎臟均有大量白色結節,如圖2 b所示。從死亡藍鰓太陽魚的肝臟、腎臟以及脾臟中均可分離到與原致病菌形態相一致的菌株，在生理生化特性方面完全相同。注射無菌生理鹽水的對照藍鰓太陽魚無死亡現象，外觀特征無明顯變化，剖檢也未發現任何病理變化。人工感染試驗結果如表1。

圖2 患病太陽魚臨床癥狀Fig.2 Clinical symptoms of diseased L.macrochirusa.示病魚體表潰爛；b.示病魚肝臟有大量白色結節

2.3 病原菌生理生化特征

由表2可知，病原菌SD1810氧化酶陰性、過氧化氫酶陽性，產生脲酶，還原硝酸鹽，水解明膠，不水解淀粉，水解七葉靈，能以檸檬酸鹽為唯一碳源生長，不能利用甘露醇、阿拉伯糖、山梨醇，不具運動性。根據《伯杰細菌鑒定手冊》，該分離菌株具備諾卡氏菌屬的基本生理生化特征，且與鰤魚諾卡氏菌大致相同[7]，可初步鑒定為鰤魚諾卡氏菌。

表1 人工感染試驗結果Tab.1 Test results of artificial injection

表2 藍鰓太陽魚病原菌及參照菌株的生理生化特性Tab.2 Physiological and biological characteristics of isolate SD1810 from L.macrochirus and reference strains of Nocardia

注：“+”陽性；“-”陰性

2.4 16S rRNA基因序列分析

采用細菌16S rRNA基因的通用引物27F和1492R擴增得到1 500 bp左右的基因片段，PCR產物凝膠電泳圖譜見圖3。PCR產物測序結果見表3。同源性檢索結果表明，菌株SD1810與諾卡氏菌屬的鰤魚諾卡氏菌核苷酸同源性高達100%。選取17株相關性較高的細菌16S rRNA基因序列進行系統發育分析并構建進化樹(見圖4)。菌株SD1810與鰤魚諾卡氏菌MS00018聚為一支，而與其他N.takedensis，N.crassostreae，N.pseudobrasiliensis，N.uniformis等菌株距離較遠。結合菌株的形態及生理生化特性，鑒定該菌株為鰤魚諾卡氏菌。

圖3 16S rRNA PCR結果Fig.3 Results of 16S rRNA amplification

2.5 藥物敏感試驗

藥敏試驗結果表明所分離的菌株SD1810對紅霉素、慶大霉素、氯霉素、阿米卡星、環丙沙星、復方新諾明、多西環素、氟苯尼考、硫酸新霉素、利福平高度敏感；對呋喃唑酮中度敏感；但對頭孢唑啉、諾氟沙星、青霉素、恩諾沙星、阿莫西林和氨芐青霉素有耐藥性，結果如表4。

表3 SD1810菌株的16S rRNA基因片段序列Tab.3 16S rRNA gene segment sequence of strain SD1810

續表3

圖4 基于16S rRNA基因序列構建的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of Citrobacter species and other bacterium based on 16S rRNA sequences

3 討論

在自然界中，諾卡氏菌分布廣泛，土壤、活性污泥、水體中均有發現[13]，諾卡氏菌由于其潛伏期長，傳染性強，在低溫季節容易爆發，目前尚無有效的治療方法，對水產養殖業的危害極大。鰤魚諾卡氏菌引發的諾卡氏菌病在中國地區水產養殖中的發病率呈上升趨勢[14]，在魚體免疫力低下或體表有傷口時特別容易感染。魚體感染諾卡氏菌后典型的癥狀是腎臟、肝臟、脾臟、鰓等器官出現慢性肉芽腫[15]。有學者認為，諾卡氏菌生長繁殖緩慢，延長病程，致使細菌與壞死組織周圍逐漸形成結締組織包膜，防止細菌擴散，作為機體的保護，從而形成結節；此外，細胞介導免疫反應使巨噬細胞和炎性細胞的增多導致慢性結節中心壞死[16]。魚類結節致病菌除了諾卡氏菌外還有舒伯特氣單胞菌[17]，但兩者所形成的結節不一樣，諾卡氏菌形成的結節界限明顯，有突起感，能導致組織硬化；而舒伯特氣單胞菌所形成的結節界限不明顯，不引起組織硬化。藍鰓太陽魚的諾卡氏菌病在每年的春季和秋季均可爆發，水溫在25～28 °C時尤為嚴重。患病藍鰓太陽魚體表有潰爛出血，嚴重者鱗片脫落，形成較大的膿瘡，鰓、內臟組織和器官有大量白色結節，與已報道的烏鱧[9]、加州鱸[10]等諾卡氏菌病的癥狀相一致。在本次病例中，發病藍鰓太陽魚食欲下降，游動緩慢，魚體發黑，體表潰爛有膿瘡，白色結節主要集中在腎臟、肝臟以及脾臟，病灶處組織較硬，其發病適溫約25 ℃，發病時間長。對分離的致病菌進行形態觀察、生理生化鑒定，結果均符合鰤魚諾卡氏菌的特征。通過16S rRNA基因序列分析以及系統發育樹的構建，SD1810與鰤魚諾卡氏菌核苷酸的同源性高達100%，與菌株MS00018親緣關系最近，確定該菌為鰤魚諾卡氏菌。

表4 鰤魚諾卡氏菌SD1810的藥物敏感性Tab.4 Sensitivity of SD1810 strain to 11 kinds of antibiotics

注：S表示高度敏感；M表示中度敏感；R表示不敏感

鰤魚諾卡氏菌有兩種類型，一種對紅霉素敏感，為α葡萄糖苷酶陽性菌；另一種對土霉素敏感，為α葡萄糖苷酶陰性菌[18]。本試驗分離的鰤魚諾卡氏菌株對紅霉素敏感，可歸類為α葡萄糖苷酶陽性菌。另外，SD1810也對慶大霉素、利福平、氯霉素、阿米卡星、氟苯尼考等10種抗生素敏感，但對頭孢唑啉、諾氟沙星、青霉素、阿莫西林、氨芐青霉素等6種抗生素具有耐藥性，與林偉[11]蔣依依[10]徐曉麗[19]等的研究結果不盡相同，這可能與不同地區、不同魚源的諾卡氏菌病的用藥情況有所不同所致，且細菌具有捕獲并整合其他菌源的耐藥基因的能力[20]，這就使得不同地區的致病菌耐藥性不一樣。在水產領域中，對鰤魚諾卡氏菌病的控制仍處于探索階段。對于α葡萄糖苷酶陰性菌感染的魚，可在飼料中添加乙酰-D-氨基葡萄糖或檸檬酸，增強病魚對土霉素的吸收，從而提高療效[21，22]。抗生素過多的使用容易導致細菌耐藥性的產生，而且大多數抗生素屬于水產禁用藥[23]。由此，當前對諾卡氏菌藥物治療方面的研究多集中在疫苗的研發領域，以降低水產行業對藥物的依賴。有研究發現，諾卡氏菌活疫苗、滅活疫苗以及重組γ干擾素均能有效地誘發魚體保護性免疫[24]，卡介苗對日本牙鲆諾卡氏菌病也有免疫作用[25]。Ho等[26]對諾卡氏菌基因疫苗的研究發現，NGL3388基因編碼的蛋白能顯著提高魚體內諾卡氏菌病的抗體滴度，但時效較短，只有2周時間。雖然學術界對諾卡氏疫苗的研究已取得一定的成果，但所得疫苗具有免疫時間短、毒性強、抗原量大，成本高等缺點，未能實現商品化，還需要進一步研發安全性高，經濟效益大的核酸疫苗、亞單位疫苗與多肽疫苗等。