一株具有煙草甲幼蟲毒殺作用蘇云金芽孢桿菌的遺傳多樣性分析及cry基因鑒定

胡逸超，雷 薇，孫建生，李季剛，鄒克興，蘇 贊，梁 偉，蔡聯合，陳 琦，鄒承武

(1.廣西中煙工業有限責任公司技術中心，廣西 南寧 530001；2.南寧國拓生物科技有限公司，廣西 南寧 530001；3.廣西大學農學院，廣西 南寧 530004)

【研究意義】蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)在產生芽孢過程中會產生具有生物殺蟲活性的δ-內毒素(ICPs)或cry蛋白(crystal toxcin protein)[1]，這些毒素對范圍較廣的昆蟲具有毒殺作用，且具有較高的特異性，對環境及非靶標生物安全，目前已廣泛用于控制農林害蟲[2]。已有研究表明，蘇云金芽孢桿菌屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus，Bc)群，包含6個非常相近的種(B.cereus、B.anthracis、B.mycoides、B.pseudomycoides、B.weihеnstephanensis和B.thuringiensis)[3]，而細菌的經典生物化學和形態學分類方法一直未能區分蘇云金芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌[4]，制約了蘇云金芽孢桿菌在農業和醫學上的應用。因此，分析蘇云金芽孢桿菌在關鍵基因序列上的遺傳多樣性并進行詳細分類，對該菌株所攜帶的cry基因類型進行檢測及其在農業上的開發應用具有重要意義。【前人研究進展】Bavykin等[5]研究認為，基于對表型性狀的原核生物分類學有較大局限性，16SrRNA的基因序列是目前分析原核生物系統發育最廣泛應用的基因，其對rRNA序列的分析已經使人們對原核生物多樣性知識有了深刻了解。Yamamoto等[6]研究發現，gyrB基因已被廣泛應用于細菌鑒定和分類的系統發育標記。gyrB蛋白的氨基酸序列比較保守，gyrB基因核苷酸序列的系統發育分析也反映了關系較近物種的進化關系[7-8]。在控制農作物害蟲上，已經證明具有cry1和cry2基因的蘇云金芽孢桿菌所產生的毒素對鱗翅目昆蟲有高效殺蟲活性。蘇云金芽孢桿菌的殺蟲效率是由cry基因編碼的晶體蛋白決定[9-10]。已有研究表明，cry蛋白對多種昆蟲的幼蟲呈現毒性活性[11]。利用聚合酶鏈反應(PCR)和序列測定可鑒定特定的cry基因，預測蘇云金芽孢桿菌的殺蟲活性，發現新的cry基因[12]。除作為研究Bt資源的重要組成部分外，cry蛋白的類型及基因型分類有助于了解Bt的殺蟲活性[13-14]。【本研究切入點】本研究課題組前期從廣西的多個煙葉貯藏倉庫中分離出一株具有較高煙草甲蟲毒殺活性的蘇云金芽孢桿菌(Bt)——GXZY032[15]，并對該菌株的生理生化指標和實際殺蟲效果進行了研究，其在煙草倉庫的煙草甲蟲害管理上具有較高的應用價值，但針對其在蠟狀芽孢桿菌群中的進化關系及cry基因驗證的研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】對蘇云金芽孢桿菌GXZY032菌株進行16S rRNA和gyrB基因序列進化分析，了解該菌株在蠟狀芽孢桿菌群中的分類關系，通過對cry基因的PCR鑒定，在基因水平上驗證該菌株的殺蟲功能，為進一步開發利用該菌株打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蘇云金芽孢桿菌(Bt) GXZY032菌株分離自廣西煙草貯藏倉庫的煙葉[15]。挑取單菌落，于LB培養基(胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g)28 ℃培養24 h。

1.2 DNA提取

取1.0 mL 菌液，8000 r/min離心1 min，去除上清培養基，得到蘇云金芽孢桿菌菌體，按照博日科技細菌基因組DNA提取試劑盒(Biospin，#BSC12S1)說明提取DNA。電泳檢測DNA質量，NanoDrop檢測OD260/OD280后，ddH2O稀釋20倍用作PCR模板。

1.3 16S rRNA序列PCR擴增并測序

16S rRNA序列擴增使用的引物為：27F：5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和1492R：5′-GTTACCTTGTTACGACTT-3′[16]。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行30個循環；72 ℃延伸5 min。預期的PCR產物片段長度為1.5 kb。通過1.0 %瓊脂糖核酸電泳檢測后，使用ABI Genetic Analyzer 3730xl(Applied biosystems)進行Sanger測序，測序引物分別為27F和1492R。獲得的序列使用Vector NTI 11.0(Invitrogen)進行拼接，所得的Contigs用于核苷酸序列分析及進化樹分析。

1.4 gyrB基因序列PCR擴增與測序

gyrB基因序列擴增使用的引物為UP-1：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′和UP-2r：5′-AGCAGGGTACGGATGTGC GAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′[17]。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min、65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，進行30個循環；72 ℃延伸5 min。預期的PCR產物片段長度為1.2 kb，通過1.0 %瓊脂糖核酸電泳檢測后，使用引物UP-1S：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′和UP-2Sr：5′-AGCAG GGTACGGATGTGCGAGCC-3′進行雙向Sanger測序。

1.5 Cry基因檢測

參考Shishir[18]的方法進行cry基因檢測，引物序列見表1。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度詳見表1，退火時間30 s，72 ℃ 30 s，進行30個循環；72 ℃延伸5 min。通過1.0 %瓊脂糖核酸電泳檢測分析每種cry基因的存在情況。

1.6 進化分析

用于進化分析的序列包括經測序所得的蘇云金芽孢桿菌(Bt) GXZY032的16S rRNA序列及gyrB基因序列，其他用于建樹的序列均來自美國國立生物技術信息中心(NCBI)的GenBank數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，每條基因序列均在結果中顯示基因索引號(Accession number)。使用CLUSTALW進行序列比對，使用Mega ediors對序列進行編輯。使用MEGA 3.1以NJ(Neighbor Joining)和ME(Minimum Evolution)算法進行基于核苷酸序列的進化樹分析。其中，選擇自展值(Boostrap值)為1000進行可信度檢驗。

表1 用于PCR擴增和測序的引物序列

2 結果與分析

2.1 基于16S rRNA序列的進化樹分析

對GXZY032菌株的16S rRNA序列進行PCR擴增測序，獲得的基因片段大小為1465 bp，經測序和BLAST比對，所測序列與Bacillusthuringiensis(GenBank accession No. KT965084.1)序列的一致性最高，達100 %。為了分析該菌株與其他芽孢桿菌的進化關系，選取多個芽孢桿菌屬(B.cereus、B.anthracis、B.mycoides、B.pseudomycoides和B.weihenstephanensis) 代表菌株的16S rRNA序列，使用ME算法構建系統進化樹(圖1)。從圖1可看出，所分離GXZY032菌株的16S rRNA序列在進化樹中與多個BtII群的菌株聚為一支，B.cereus的兩個群B.cereusI和B.cereusII分別聚為一支，其中包含了不同Bt血清型菌株，但該分支的執行值較低，多個數值出現小于50 %的置信值。B.mycoides和B.weihenstephanensis聚在一個較遠的分支，且該分支的置信值為99 %。

以引物up1和up2r對GXZY032菌株的gyrB基因序列進行擴增測序，獲得1.2 kb的目標基因序列。從GenBank數據庫中下載屬于B.cereus不同群菌株的gyrB基因序列，通過比對和序列修剪，最終使用47個菌株的gyrB基因序列與GXZY032菌株的gyrB基因序列共同構建系統進化樹(圖2)。從進化樹的結構可看出，BtI、BtII、B.cereusI和B.cereusII 4個群分別聚為一支，且進化樹大分支之間的置信值均較高；GXZY032菌株以較高的置信值與BtII聚集在一個分支，與B.thuringiensisserroskildiensisIEBC-T45菌株距離最近。

2.2 Cry基因種類檢測

為了明確GXZY032菌株所具有的殺蟲相關cry基因類型，對表1中所列舉的8種cry基因進行PCR擴增及瓊脂糖電泳檢測，獲得的PCR產物大小分別為277、639和348 bp(圖3)，說明GXZY032菌株包含的cry基因主要為cry1、cry2和cry10。

3 討 論

16S rRNA序列的核苷酸序列常用于進行菌株分類和種屬鑒定[5]。本研究以芽孢桿菌屬不同菌株的16S rRNA序列構建進化樹，對所分析的菌株進行歸類，發現雖然B.cereus的2個群B.cereusI和B.cereusII分別聚在一個獨立分支，但這2個分支的置信度不高，在多個分支上出現較小數值(小于50 %)，說明這些菌株在16S rRNA序列的核苷酸序列與其他分支之間差異不明顯，可能是各分支置信度較低的原因。B.mycoides和B.weihenstephanensis聚在一個分支，這個分支的置信度較高，為99 %，且與其他菌株在遺傳距離上較遠。而BtI和BtII群的菌株被混合聚在一個大分支，且置信值較低，說明這2個群的菌株在16S rRNA序列上差異較小。其中，一個典型的Bt菌株Btser.berlinerATCC 10792正好處于這個大分支中。GXZY032菌株與多株蘇云金芽孢桿菌聚在一起，說明從16S rRNA序列的水平上分析，可證實GXZY032菌株屬于蘇云金芽孢桿菌，與前期對該菌株表型分析鑒定及生理生化檢測結果一致[15]。

Bootstrap值為1000，每個枝的前部分為該序列的GenBank基因號(Accession number)，后部分為該序列的來源菌株名稱或編號 The boostrap confidence value was 1000，the front part of the branch was the accession number of the sequence，the rear part was the name of strain

本研究中，基于16S rRNA序列進行B.cereus的種屬關系分析及群類分析具有一定的可行性，一些差異較明顯的分支得到了分離，例如兩個群B.cereusI和B.cereusII在進化樹上分別出現在不同的分支。另一方面，16S rRNA序列在分析B.cereus的種屬關系及群類上的分辨率不高，主要原因是在親緣關系較近的物種之間16S rRNA序列通常只有單個堿基或者少數幾個堿基的差異，造成進化樹分支置信度較低。

Bootstrap值為1000，每個枝的前部分為該序列的GenBank基因號(Accession number)，后部分為該序列的來源菌株名稱或編號The boostrap confidence value was 1000，the front part of the branch was the accession number of the sequence，the rear part was the name of strain

圖3 cry基因種類鑒定結果

除16S rRNA序列外，gyrB基因序列也常用于細菌的遺傳多樣性分析[5-7]。gyrB基因是普遍存在于細菌內編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白的基因，具有比16S rRNA序列更高的變異率，而根據大腸桿菌(Escherichiacoli)、假單胞菌(Pseudomonasputida)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)DNA促旋酶(gyrases)的氨基酸保守序列進行設計的簡并引物up1和up2r，被廣泛運用于擴增gyrB基因B亞基序列[17]。在進行B.cereus的研究中，gyrB基因序列也被用于種屬關系分析及群類分析[19]。本研究結果表明，與16S rRNA序列的進化樹相似，gyrB基因序列的進化樹在BtI和B.cereusI兩個群得到了聚集，但是具有更高的置信度，由此可看出，進行芽孢桿菌的群類分析時，gyrB基因序列比16SrRNA序列具有更高的分辨率；B.thuringiensisserkenyaeIEBC-T04B001、B.thuringiensisserthompsoniIEBC-T12和B.thuringiensisserhigoIEBC-T44 3個菌株均在16S rRNA和gyrB基因序列的2個進化樹中聚集在BtI群的一簇中。此外，2個進化樹都在B.cereusI這一簇中包含了B.thuringiensissertolworthiIEBC-T09菌株的序列；基于16S rRNA序列與gyrB基因序列的進化樹在一定程度上具有一致性，與Punina[19]的報道一致。

本研究從gyrB基因序列的進化樹中還發現GXZY032菌株分別聚集到兩個大的分支，并具有較高的置信值。在其中一個分支中，包含了BtⅡ和BtⅢ。其中，GXZY032菌株與BtⅡ群聚到了一個大簇中，且這個簇中的每個分支都具有較高的置信值，更進一步證實GXZY032菌株屬于蘇云金芽孢桿菌的BtⅡ群，可為后期利用該菌株進行基因組分析或更進一步的應用研究提供堅實的分類基礎。

不同的δ-內毒素類型對不同昆蟲的毒殺作用存在差異[20]，因此進行cry基因類型的鑒定對于新發現蘇云金芽孢桿菌的研究具有重要指導意義。已有研究表明，cry1基因在蘇云金芽孢桿菌中出現的頻率最高[22]，而cry基因的種類數量眾多，本研究僅檢測其中的8種類型。此外，不同來源的菌株可能會在基因序列上具有多態性，如果所擴增的片段大小與預期大小存在差異，原因可能是引物結合位點發生了變化，也有可能是包含有新的cry基因[20]。GXZY032菌株除了包含cry1，cry2和cry10基因外有可能還包含其他類型的cry基因，將來可通過基因組測序深入挖掘該菌株與內毒素相關的基因信息。

4 結 論

經基于16S rRNA和gyrB基因序列的多態性分析，明確了具有煙草甲幼蟲毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌菌株GXZY032屬于BtⅡ群；經PCR驗證，GXZY032菌株具有cry1、cry2和cry103種類型cry殺蟲基因。

致 謝：在本研究中，陳琦和鄒承武完成數據分析和論文初稿的寫作；孫建生、李季剛、鄒克興、蘇贊、梁偉和蔡聯合參與實驗設計和實驗結果分析，特致謝意。