RNA干擾抑制Paralemmin-3表達對6-OHDA致帕金森性神經損傷的保護作用

侯宇峰 蒲亞嵐 張鳳娟 蔣紹軍

帕金森是老年人群的常見的以紋狀體多巴胺神經遞質減少以及中腦黑質多巴胺能神經元變性為主要特征的神經元退行性疾病，嚴重損害身體健康并降低生活質量[1]。目前尚且沒有有效地治療方法阻止或修復帕金森引發的神經細胞損傷。關于帕金森的致病機理，有諸多研究表明其與基因突變、蛋白水解應激、氧化應激、免疫學異常、線粒體功能障礙、泛素蛋白酶體系統功能障、細胞凋亡礙等諸多機制有關，最終通過多種級聯反應導致多巴胺能神經細胞凋亡、變性和壞死[2]。其中，氧化應激引起的線粒體功能異常、內質網應激引起的蛋白質折疊異常等因素都可稱為帕金森分發病誘因[3]。當前的研究熱點集中于降低神經元的氧化應激損傷，抑制神經元凋亡。Paralemmin-3(PALM3)屬于Paralemmin蛋白家族，于1992年首次在非洲爪蛙中被發現[4]，并發現其可參與膜蛋白的運輸、參與信號傳導[5]。Chen等[6，7]研究在急性肺損傷的研究中發現，敲低PALM3能夠顯著提高細胞的抗氧化應激能力，從而顯著抑制細胞凋亡。這些表明PALM3在保護細胞免受氧化應激刺激中起著關鍵作用。為研究PALM3在保護神經細胞中的作用，本實驗采用6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)處理的SH-SY5Y細胞制造帕金森神經損傷模型，通過敲低PALM3，觀察比較6-OHDA對細胞的損傷作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 將SH-SY5Y細胞(購自國家實驗細胞資源共享平臺)鋪板于含有10%胎牛血清(Gibco，10099141)的D-MEM/F12(1∶1)培養基(Gibco，12400-024)，置于37℃，5%CO2條件下培養。用0.25%胰酶(Gibco，25300054)消化細胞，3 d傳代一次。將細胞分為4組，不做任何處理的細胞組為對照組；用100 μmol/L 6-OHDA處理的細胞組為模型組；轉染control siRNA的細胞組為siRNA-control組以及轉染干擾PALM3的細胞組為siRNA-PALM3組。

1.2 RNA干擾 搜索PALM3在NCBI上的序列(NM_001367327.1，1104-1126，TTCCATAGAAGGGGAAGATGTGC)，利用在線工具siDirect version 2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)設計并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成小干擾RNA(Small interfering RNA；siRNA):5’-ACAUCUUCCCCUUCUAUGGAA-3’及5’-UGUAGAAGGGGAAGAUACCUU-3’。同時合成陰性對照siRNA：5’-UAUGGAAUUCCCCUUCACAUC-3’及5’-ACCUUGAAGGGGAAGAUUGUA-3’。將陰性對照siRNA轉染至siRNA-control組細胞，干擾PALM3的siRNA轉染至siRNA-PALM3組細胞。轉染6 h后更換培養基，繼續培養24 h后，RT-PCR和Western blot方法檢測4組細胞中的PALM3的表達水平。實驗重復3次。

1.3 RT-PCR檢測 收集上述4組細胞樣品，提取RNA后，使用全式金公司的TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix(AT401-01)試劑盒進行反轉錄，獲得cDNA。根據GeneBank中PALM3的序列(NM_001367327.1)并借助primer 5.0設計特異性引物(F：5’-AAAGTTGAGGGACATTTGAGG-3’；R：5’-AGCAGTGGCTGGCATTCG-3’)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。將上述cDNA作為模板，按照PCR程序進行擴增：95℃，5 min；95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min；30個循環；72℃，10 min。PCR產物經核酸凝膠電泳后置于Bio-Rad凝膠成像系統(SYSTEM GelDoc XR+，1708195) 中成像。使用Image J分析軟件進行灰度值分析，檢測PALM3的轉錄水平。實驗重復3次。

1.4 Western blot檢測 收集上述4組細胞，進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳：濃縮膠恒壓80 V， 20 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍到凝膠底部。使用Bio-Rad半干轉印槽(Trans-Blot SD，170-3940)在恒壓15 V，30 min條件下轉印至PVDV膜(生工，F019532-0010)。取下PVDF膜放入封閉液(TBST，5%脫脂奶粉，pH值7.4)中室溫孵育2 h；使用abcam公司生產的PALM3一抗稀釋液(ab189996，1∶5 000)室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；使用全式金公司生產的HRP標記的二抗羊抗兔IgG 稀釋液(HS101-01，1∶10 000)室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；最后根據ECL化學發光液(上海天能)使用說明，將PVDF膜置于Bio-Rad凝膠成像系統中顯影。實驗重復3次。

1.5 細胞凋亡檢測 用Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(Sigma，APOAF-20TST)檢測各組細胞凋亡情況。同時購買abcam公司的一抗及相應二抗，用Western blot方法檢測各組細胞內p53(abcam，ab26)、Bcl-2(abcam，ab692)、Bax(abcam，ab77566)以及活化的caspase-3(abcam，ab13585)、caspase-9(abcam，ab69514)等蛋白的表達水平。

1.6 氧化應激指標檢測

1.6.1 ROS檢測：收集上述4組細胞，使用Abcam公司的DCFDA Cellular Ros Detection Assay Kit (Abcam ab113851)并按照其說明書操作，檢測4組細胞內的ROS含量。

1.6.2 LDH檢測：收集4組細胞培養液，使用碧云天生物技術公司的乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒(C0016) 并按照其說明書操作，檢測各組細胞培養液中的LDH含量。

1.6.3 GSH檢測：收集4組細胞，使用碧云天生物技術公司的GSH和GSSG檢測試劑盒(S0053) 并按照其說明書操作，檢測各組細胞中的GSH含量。

2 結果

2.1 PALM3蛋白表達檢測 RT-PCR結果顯示，PALM3在對照組、模型組和siRNA-control組的細胞中的轉錄水平無顯著差異(P>0.05)；PALM3在siRNA-PALM3組的轉錄水平較其他3組顯著降低(P<0.05)。Western blot結果顯示，PALM3在對照組、模型組和siRNA-control組的細胞中的表達水平無顯著差異(P>0.05)；PALM3在siRNA-PALM3組的表達水平較其他3組顯著降低(P<0.05)。以上結果表明siRNA-PALM3組中細胞中PALM3敲低成功，該組細胞內PALM3的表達被抑制。見圖1、2，表1、2。

圖1 PALM3在各組細胞中的轉錄水平

表1 PALM3在各組細胞中的轉錄水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-control組比較，△P<0.05

圖2 PALM3在各組細胞中的表達水平

表2 PALM3在各組細胞中的表達水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-control組比較，△P<0.05

2.2 PALM3敲低對SH-SY5Y細胞凋亡的影響 流式細胞術結果顯示，與對照組相比，模型組、siRNA-control組及siRNA-PALM3組內細胞凋亡數顯著增加(P<0.05)，表明6-OHDA成功誘導SH-SY5Y細胞凋亡。與模型組相比，siRNA-PALM3組細胞凋亡數顯著降低(P<0.05)，表明敲低PALM3，可顯著抑制6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞凋亡。見圖3，表3。

圖3 PALM3敲低對SH-SY5Y細胞凋亡的影響

表3 PALM3敲低對SH-SY5Y細胞凋亡的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-control組比較，△P<0.05

2.3 PALM3敲低對凋亡信號蛋白表達的影響 與對照組比較，其他3組的p53和Bcl-2表達量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，siRNA-PALM3組細胞的p53和Bcl-2表達量顯著升高(P<0.05)。Bax，活化的Caspase-3及Caspase-9在模型組、siRNA-control組和siRNA-PALM3組的表達量較對照組顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，siRNA-PALM3組細胞中的上述3種蛋白表達量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4，表4。

圖4 PALM3敲低對凋亡信號蛋白表達的影響

表4 PALM3敲低對凋亡信號蛋白表達的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-control組比較，△P<0.05

2.4 PALM3敲低對氧化應激指標的影響 相比對照組，其他組細胞內ROS及細胞培養液中的LDH含量均顯著增高(P<0.05)；與模型組相比，siRNA-PALM3組細胞的p53和Bcl-2表達量顯著升高(P<0.05)。相比對照組，其他組細胞內GSH含量均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，siRNA-PALM3組細胞的p53和Bcl-2表達量顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 PALM3敲低對氧化應激指標的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-control組比較，△P<0.05

3 討論

帕金森是一種較常見的與年齡有關的神經退行性疾病，以黑質致密部的多巴胺能神經元的選擇性缺失為特征，并引起身體震顛、僵硬和行動遲緩[1，8]。雖然具體的致病原因尚不清楚，但是有研究表明，氧化應激、線粒體功能紊亂、內質網應激及蛋白錯誤折疊都與該病密切相關[9-11]。提高神經細胞的抗氧化能力，保護其免受氧化應激而凋亡是研究熱點之一。

6-OHDA是多巴胺的羥基化類似物，常被用作制作多巴胺能神經元變性模型[12]，它能夠誘導多巴胺能神經元的ROS依賴性細胞凋亡[13，14]。本實驗中，SH-SY5Y細胞經100 μmol/L的6-OHDA處理后，出現較高的凋亡率，表明成功制造出帕金森性神經損傷模型，為后續實驗做好了基礎。

真核細胞主要的凋亡傳導通路有：死亡因子及其受體介導的外部傳導途徑、線粒體凋亡途徑、內質網途徑和B粒酶凋亡途徑[15]。熱點涉及p53蛋白、caspase蛋白家族和Bcl-2蛋白家族。6-OHDA可誘導細胞產生p53依賴性凋亡[14]，在細胞凋亡過程中，caspase-3和caspase-9被活化[16，17]，并可以裂解Bcl-2，Bax含量升高[18]。

PALM3在膜蛋白的運輸或者靶向等方面有重要作用，并參與信號轉導[5]。陳旭昕等[19]的研究表明，干擾PALM3表達，可緩解LPS誘導的肺泡上皮細胞的炎性反應。PALM3在保護細胞降低凋亡方面有重要作用。本實驗通過RNA干擾技術，敲低了SH-SY5Y 細胞中PALM3的表達，經6-OHDA處理后，細胞凋亡數量、ROS含量、LDH、p53、Bcl-2、Bax以及活化的caspase-3、caspase-9較模型組顯著減少；而細胞內GSH含量顯著增加。以上實驗結果表明，敲低PALM3后，SH-SY5Y 細胞降低了對6-OHDA誘導的應激，減少了凋亡。

綜上所述，干擾SH-SY5Y細胞中PALM3表達，可顯著減輕6-OHDA誘導的細胞毒性作用，可能是由于PALM3表達的減少，抑制了p53表達進而抑制細胞凋亡的caspase通路從而減輕了細胞損傷。