泡菜自然發酵中乳酸菌的分離鑒定及生物學特性的研究

戚家莉，王海潮

（1.安徽省壽縣第一中學，安徽 壽縣 232200；2.宿州學院 生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000）

泡菜能為人體提供所需的多種營養元素，其水分、碳水化合物、維生素、鈣、鐵、磷等[1-2]，泡菜富含0.4%～8.0%乳酸，經過乳酸菌的發酵，蔬菜的營養物質不僅沒有被破壞，而且乳酸菌利用原料中可溶性物質代謝產生大量的乙酸、乳酸和多種氨基酸、酶、維生素等，提高了發酵蔬菜的營養價值[3-5]。泡菜具有保持腸道保健和消炎殺菌的功能，從泡菜中分離的乳酸菌含量很高，乳酸菌是參與調節人體腸道微生態平衡的主要菌系[6-7]。泡菜中的乳酸菌菌體及其代謝產生的維生素和有機酸對人體有多種功能，可幫助消化，促進胃腸道蠕動，代謝產物有機酸可使腸道內的滲透壓增高，水分分泌亢進，糞便中水分增高而緩解便秘[8]；乳酸菌產生的有機酸對食品中微生物也具有較好的抑制作用。此外，泡菜中的乳酸菌有降低膽固醇、提高免疫力的功效[9-11]。

我國是蔬菜生產大國，蔬菜品種、人均消費和出口均居世界前列，每年的蔬菜產量為數億噸，而發酵泡菜是蔬菜深加工的一種重要形式，目前國內外泡菜的加工工藝研究的熱點主要集中在接種和發酵這個環節上，如發酵工藝條件的優化、乳酸菌菌種的選擇等，直接影響著泡菜加工后的口感、色澤、滋味等品質及產品產量，是當今泡菜加工研究的熱點[12-14]，而對自然發酵研究較少。傳統自然發酵法是在一定的溫度下將新鮮的蔬菜加入適當食鹽及其他輔料，利用原料中原有的酶及所處環境內乳酸菌、耐酸性酵母等微生物進行發酵而制得最終發酵產品，最典型的產品就是泡菜。

試驗以白貝自然發酵黃瓜、蘿卜、胡蘿卜等為原料進行自然發酵制作泡菜，從中分離得到性能優良的乳酸菌，并通過生理生化試驗，對分離得到的乳酸菌進行鑒定，并對其生物學特性進行分析，為提高發酵泡菜的品質及其營養價值奠定一定的基礎。

1 試驗部分

1.1 試驗材料

1.1.1 材料

黃瓜、蘿卜、胡蘿卜、食鹽，均為市售。

1.1.2 儀器

YP202N型電子天平，上海精密科技儀器有限公司產品；電子萬用爐，天津市泰斯特儀器有限公司產品；GI54DWS型高壓滅菌箱，致微（廈門） 儀器有限公司產品；SHP-250型生化培養箱，上海三發科學儀器有限公司產品；SW-CJ-IFD型超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司產品；DHG-9053A型恒溫干燥箱，上海一恒科技有限公司產品；泡菜壇、燒杯、玻璃棒、三角燒瓶、試管、培養皿、接種環、接種針、顯微鏡、酒精燈、載玻片、香柏油、膠頭滴管、移液管、洗耳球、玻璃涂布器、稱量紙、pH試紙、脫脂棉、紗布、牛皮紙、細繩子、濾紙等。

1.1.3 試劑

牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、葡萄糖、甲基紅、95%乙醇、磷酸氫二鉀、磷酸二氫銨、硫酸鎂、檸檬酸鈉、溴香草酚藍乙醇液、硫代硫酸鈉、醋酸鉛、30%過氧化氫、對二甲基氨基苯甲醛、濃鹽酸、乙醚、氫氧化鉀、草酸銨、結晶紫、碘片、碘化鉀、蕃紅、明膠等。

1.2 試驗方法

1.2.1 泡菜的制作

選擇含糖豐富且質地嫩脆的蘿卜、胡蘿卜、黃瓜等蔬菜作為腌制泡菜的原料。用刀把不適于腌制的部分去除，如蘿卜的菜葉及粗皮，并把蘿卜、胡蘿卜、黃瓜切成小塊，方便裝壇內進行腌制。整形后，把清洗干凈的蔬菜晾曬3～4 h。在蔬菜裝壇前直接用食鹽腌制或是放入25%的食鹽溶液，使蔬菜部分脫水變軟。把處理過的蔬菜分別裝入壇內，壓緊，再使用蒸餾水配置好的質量分數為6%～8%的食鹽水倒入罐內，食鹽水一定要淹沒蔬菜，鹽水離壇口3～5 cm，防止泡菜腌制后鹽水溢出影響泡菜的品質。然后蓋上壇蓋，并用保鮮膜裹緊，在厭氧條件下乳酸菌可以生長良好，同時也可以抑制好氧細菌及霉菌的生長。把裝有原料的泡菜壇置于陰涼通風處，在溫度10℃左右腌制10～15 d備用。

1.2.2 培養基的配制

（1） 牛肉膏蛋白胨培養基。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g， NaCl 5 g， 瓊脂 15～20 g， 水 1 000 mL， pH 值7.0～7.2。

（2） 檸檬酸鹽培養基。NH4H2PO41 g，K2HPO41 g，NaCl 5 g， MgSO40.2 g， 檸檬酸鈉 2 g， 瓊脂 15～20 g，蒸餾水1 000 mL，1%溴香草酚藍乙醇液 10 mL，將上述各成分加熱溶解后，調節pH值至6.8，然后加入指示劑，搖勻，用脫脂棉過濾。制成后為黃綠色。

（3） 蛋白胨水培養基。 蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.6。

（4） 葡萄糖蛋白胨水培養基。葡萄糖5 g，蛋白胨5 g，K2HPO42 g，蒸餾水1 000 mL，將上述各成分溶于 1 000 mL水中，調pH值7.0～7.2，過濾。

（5）醋酸鉛培養基。pH值7.4的牛肉膏蛋白胨瓊脂100 mL，硫代硫酸鈉0.25g，10%的醋酸鉛水溶液1 mL，將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基100 mL加熱溶解，待冷卻到60℃時加入硫代硫酸鈉0.25 g，調pH 值7.2。

（6） 明膠培養基。牛肉膏蛋白胨液100 mL，明膠 12～18 g，pH值7.2～7.4，在水浴鍋中將上述成分溶化，不斷攪拌。溶化后調pH值7.2～7.4。

所有培養基在121℃下滅菌20 min。

1.2.3 主要染色液的配制

（1） 溴麝香草酚藍指示劑。溴麝香草酚藍0.04 g，0.01 mol/L NaOH 6.4 mL，蒸餾水93.6 mL，溴麝香草酚藍pH值6.0～7.6，顏色由黃變藍，常用質量分數為0.04%。

（2） 甲基紅試劑。甲基紅0.04 g，95%乙醇60 mL，蒸餾水40 mL，先將甲基紅溶于95%乙醇中，然后加入蒸餾水即可。

（3） 吲哚試劑。 對二甲基氨基苯甲醛 2 g，95%乙醇190 mL，濃鹽酸40 mL。

（4） 草酸銨結晶紫染液。結晶紫1 g，95%酒精20 mL，草酸銨0.8 g和蒸餾水80 mL，混合，靜置48 h后使用。

（5） 盧戈氏碘液。I21.0 g，KI 2.0 g， 蒸餾水300 mL，先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，待碘片全溶后，加足水分即成。

（6） 蕃紅復染液。蕃紅0.25 g，95%的酒精10 mL，蒸餾水90 mL，將蕃紅溶于乙醇中，再用蒸餾水稀釋。

1.2.4 乳酸菌的分離

用移液管分別吸取少量發酵好的泡菜汁液，置于平板中心處釋放，然后用玻璃涂布器涂布均勻，并在培養皿外貼上標簽，最后將培養皿放在37℃的恒溫培養箱中培養48 h，觀察菌的生長情況，若菌落太多形成菌苔，可對泡菜汁液進行適當的稀釋再進行涂布。對其中具有典型乳酸菌菌落特征的菌株進行反復分離、純化至純菌落。從胡蘿卜泡菜中分離出3株乳酸菌，分別是A-1，A-2和A-3菌株。從蘿卜泡菜中分離出3株乳酸菌，分別是B-1，B-2和B-3菌株。從黃瓜泡菜中分離出4株乳酸菌，分別是C-1，C-2，C-3和C-4菌株。

1.2.5 乳酸菌的鑒定

（1） 形態鑒定。把接種的牛肉膏蛋白胨平板后，倒置放在37℃的恒溫培養箱中培養48 h，觀察并記錄不同泡菜中乳酸菌菌落的數目、種類、形狀、大小、顏色、有無隆起、濕潤情況、光澤度、邊緣等形態學特征。

（2） 生理生化鑒定。將純化過的菌落進行挑取，分別接種到蛋白胨水培養基、葡萄糖蛋白胨水培養基、檸檬酸鹽培養基、醋酸鉛培養基、明膠培養基以及過氧化氫酶試驗培養基上，放在37℃的恒溫培養箱中培養48 h，此操作在超凈工作臺上進行。觀察菌的生長情況，培養基的顏色變化和加入變色劑后培養基顏色變化，并記錄現象。

①檸檬酸鹽試驗。把黃瓜、蘿卜、胡蘿卜等泡菜中分離出來的乳酸菌分別接種在檸檬酸鹽培養基上，此過程在超凈工作臺上進行，接種完畢后，把接種后的培養基放在37℃的恒溫培養箱培養48 h，觀察檸檬酸鹽斜面培養基上有無細菌生長和是否變色，藍色為陽性，綠色為陰性。②吲哚試驗。把黃瓜、蘿卜、胡蘿卜等泡菜中分離出來的乳酸菌分別接種在蛋白胨水培養基上，此過程在超凈工作臺上進行，接種完畢后，把接種后的培養基放在37℃的恒溫培養箱培養48 h，然后在培養基中加入3～4滴乙醚，搖動數次，靜置1 min，待乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚和培養物之間產生紅色環狀物為陽性反應。③甲基紅試驗。把黃瓜、蘿卜、胡蘿卜等泡菜中分離出來的乳酸菌分別接種在葡萄糖蛋白胨水培養基上，此過程在超凈工作臺上進行，接種完畢后，把接種后的培養基放在37℃的恒溫培養箱培養48 h，然后在培養基中加入3～4滴甲基紅試劑，培養基變為紅色為陽性，變為黃色為陰性。④硫化氫試驗。把黃瓜、蘿卜、胡蘿卜等泡菜中分離出來的乳酸菌分別接種在醋酸鉛培養基上，此過程在超凈工作臺上進行，接種完畢后，把接種后的培養基放在37℃的恒溫培養箱培養48 h，觀察黑色硫化鉛的產生。⑤明膠液化試驗。把黃瓜、蘿卜、胡蘿卜等泡菜中分離出來的乳酸菌分別穿刺接種在明膠培養基上，此過程在超凈工作臺上進行，接種完畢后，把接種后的培養基放在37℃的恒溫培養箱培養48 h，觀察明膠是否液化。⑥過氧化氫酶試驗。用接種針把分離純化的乳酸菌涂抹在過氧化氫中，有氣泡產生菌體含有過氧化氫酶。

2 結果與分析

2.1 泡菜的制作

泡菜腌制過后，顏色不太鮮亮，質地較軟，味道爽口。蘿卜與胡蘿卜泡菜顏色變化較小，黃瓜泡菜的顏色由深綠色變成了暗綠色。3種泡菜壇的底部均有乳白色像牛奶一樣的乳酸菌落。說明蔬菜在鹽水質量分數為6%～8%的情況下會發酵產生大量的乳酸菌。

胡蘿卜、蘿卜和黃瓜泡菜見圖1。

2.2 乳酸菌的分離

從胡蘿卜、蘿卜、黃瓜泡菜中分離出A-1，A-2，A-3，B-1， B-2， B-3， C-1，C-2，C-3 和C-4共10株乳酸菌。胡蘿卜泡菜中含有A-1，A-2和A-3乳酸菌菌株；蘿卜泡菜中含有B-1，B-2和B-3乳酸菌菌株；黃瓜泡菜中含有C-1，C-2，C-3和C-4乳酸菌菌株。

蘿卜泡菜中乳酸菌菌落分布見圖2。

2.3 乳酸菌的鑒定

2.3.1 形態學鑒定

從泡菜中分離出多株乳酸菌，選取其中占優勢的10株菌進行鑒定，經革蘭氏染色后在油鏡下觀察形狀結構、菌落形態。這10株乳酸菌革蘭氏染色均為陽性，無芽孢、無鞭毛、不運動，具有桿菌形態學特征。

泡菜乳酸菌的形態學特征鑒定結果見表1。

2.3.2 生理生化鑒定

（1） 檸檬酸鹽試驗。所有泡菜中乳酸菌的檸檬酸鹽試驗的培養基，隨著時間的推移，由深綠色變成深藍色，說明乳酸菌可以利用檸檬酸鹽作為碳源進行生長繁殖。

檸檬酸鹽試驗結果見表2。

（2） 吲哚試驗。所有泡菜中乳酸菌的吲哚試驗反應結果，在乙醚和培養物之間產生紅色環狀物，為陽性反應。

吲哚試驗結果見表3。

（3） 甲基紅試驗。胡蘿卜泡菜中A-1，A-2和A-3菌株的甲基紅試驗是陰性；蘿卜泡菜中B-1，B-2和B-3菌株的甲基紅試驗是陽性；黃瓜泡菜中C-1和C-2菌株的甲基紅試驗是陽性，C-3和C-4菌株的甲基紅試驗是陽性。

甲基紅試驗結果見表4。

表1 泡菜乳酸菌的形態學特征鑒定結果

表2 檸檬酸鹽試驗結果

表3 吲哚試驗結果

表4 甲基紅試驗結果

（4） 硫化氫試驗。所有泡菜中乳酸菌的硫化氫試驗反應結果均為陰性，無黑色硫化鉛形成。

硫化氫試驗結果見表5。

表5 硫化氫試驗結果

（5）明膠化試驗。所有泡菜中乳酸菌的明膠化試驗反應結果均為陽性，明膠由固體變成液體。

明膠化試驗結果見表6。

表6 明膠化試驗結果

（6） 過氧化氫酶試驗。所有泡菜中乳酸菌的過氧化氫試驗均產生大量氣泡。

過氧化氫酶試驗結果見表7。

表7 過氧化氫酶試驗結果

3 討論

根據張剛的《乳酸細菌-基礎、技術和應用》[15]中所提到的乳酸桿菌的標準可以得到乳酸桿菌可以利用糖作為碳源，但不可以分解利用蛋白質、氨基酸。但是，有個別試驗的結果于此標準不符，例如崔艷偉等人[16]的乳桿菌的分離及鑒定試驗。

試驗上述個別試驗結果與乳酸桿菌的標準結果不符，例如乳酸菌的吲哚試驗和明膠化試驗結果均為陽性，可能是由于乳酸菌菌株自身的某種特性或在培養過程中發生變異導致菌株的部分糖醇發酵結果發生改變，造成了生理生化鑒定的困難；也可能是細菌微量生化鑒定管產生的不確定因素所導致的。為了對分離菌株進行準確的鑒定，試驗可以采用16S rDNA序列同源性分析方法進行進一步的鑒定，從而確定乳酸菌的菌種。

4 結論

從胡蘿卜泡菜中分離出A-1，A-2和A-3菌株；從蘿卜泡菜中分離式的B-1，B-2和B-3菌株；從黃瓜泡菜中分離出C-1，C-2，C-3和C-4菌株。經過形態特征和生理生化特征初步鑒定A-1，A-2，A-3， B-1， B-2， B-3， C-1， C-2， C-3 和 C-4 菌株屬于乳酸桿菌。