金柑多酚提取與抗氧化活性分析

史文景，游雙紅， 胡佳羽， 江 銘， 王 昱， 繆伊雯，鄧 鑫， 羅 明， 陳 宇

（1.重慶市農業科學院 果樹研究所，重慶 401329；2.長江師范學院 生命科學與技術學院，重慶 408100）

金柑 （Fortunella japonica（Thunb） Swingle） 又稱金橘、金棗，屬蕓香科金柑屬植物，原產于我國華南地區。金柑果實體積小，形狀呈橢圓形，果肉和果皮能夠同時食用，味道酸甜，富含維C、芳香油、類胡蘿卜素、類黃酮、檸檬苦素等多種活性物質[1]，以及鐵、鈣、鉀、鈉、鋅、銅、硒等礦質物元素[2]，營養價值極高。多酚是一類酚羥基類及其衍生物的總稱，存在于多種水果中，是源于丙氨酸代謝途徑和莽草酸代謝途徑的重要次生代謝產物，對于植株攝取營養、合成蛋白質、進行光合作用等多種生理活動有著重要意義，因其具有很強的抗氧化作用而被稱為“第七大營養素”[3]。豐富的多酚類物質使金柑有很高的藥理價值，如抗氧化、抑菌、抗癌、調節免疫、降血脂和防治心腦血管疾病等功效[4]。植物多酚具有廣闊的應用前景，已成為食品和藥品開發領域的熱點，其提取方法有溶劑萃取法[5]、超聲波提取法[6]、酶法輔助提取[7]、微波提取法[8]和超臨界流體提取法[9]等，抗氧化活性分析方法主要有DPPH自由基清除法[10]、ABTS自由基清除法[11]、鐵離子抗氧化能力法[12]等。當前，對于金柑多酚的提取研究多集中于一種萃取溶劑，沒有對不同萃取溶劑的提取效果進行對比分析，試驗通過分析不同萃取溶劑對金柑多酚的提取效果及抗氧化活性影響，為金柑多酚提取方法優化及合理利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：金柑。

試劑：抗壞血酸標準品（色譜純）、沒食子酸標準品 （色譜純）、蘆丁標準品 （色譜純）、DPPH（2,2-diphenyl-1-pricrylhydrazyl radical） ， 2,2'-azinobis（ 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） （ ABTS）和 TPTZ[2,4,6-tris（ 2-pyridyl）-s-triazine]， 上海源葉生物科技有限公司提供；其他試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-8型數顯恒溫水浴鍋，金壇市榮華儀器制造有限公司產品；PT-3502C型全波長酶標分析儀，北京普天新橋技術有限責任公司產品；SB-5200BD7D型超聲波清洗儀，寧波新芒生物科技有限公司產品；FW-100型高速萬能粉碎機、FW-100型電熱鼓風干燥箱，上海浦東榮豐科學儀器有限公司產品；JA50型電子分析天平，常州市幸運電子設備有限公司產品；TGC-16B型離心機，上海安亭科學儀器廠產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 金柑的預處理

將金柑切薄片，于70℃烘箱中烘干至恒質量，粉碎，過80目篩，粉末收集于自封袋中，存儲于干燥器中備用。

1.3.2 金柑多酚提取工藝流程

準確稱取經預處理后的金柑粉100 g（準確至0.1 g），與提取劑混合（料液比1∶15），超聲提取（70 ℃，40 min） ， 離心 （10 000 r/min，15 min） ， 取上清液，減壓濃縮得到甲醇提取物浸膏。將浸膏溶解于200 mL蒸餾水，分別采用200 mL萃取劑（正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、異戊醇） 進行萃取，重復萃取3次，減壓濃縮得到提取物浸膏，然后用甲醇溶解、離心后取上清液，分別測定多酚、類黃酮含量和抗氧化活性[13]。

1.3.3 多酚含量測定

參照譚飔等人[14]方法，選取不同濃度沒食子酸標準溶液和樣品50 μL于96孔板中，然后分別加入福林酚試劑10 μL，充分混合并避光反應6 min，加入質量分數7%Na2CO3溶液100 μL和去離子水80 μL，充分混合后避光90 min，于波長760 nm處測定其吸光度，重復3次。以沒食子酸濃度作為橫坐標，吸光度作為縱坐標繪制標準曲線，多酚含量以沒食子酸含量表示。

1.3.4 總黃酮的測定

參照譚飔等人[14]方法，以蘆丁為標準品測定總黃酮含量。取不同濃度梯度的蘆丁標準溶液和樣品10 μL加入96孔板中，加入質量分數5%NaNO2溶液10 μL，混合后在室溫下靜置6 min，然后加入質量分數4%NaOH溶液100 μL和體積分數60%乙醇溶液120 μL，混勻后室溫反應15 min，于波長510 nm處測定其吸光度，3次重復。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，黃酮含量以蘆丁當量來表示。

1.3.5 抗氧化活性測定

（1） DPPH法。取樣品溶液和一定濃度梯度的抗壞血酸標準溶液100 μL于96孔板中，加入0.5 mmol/L的DPPH溶液100 μL，混勻后放置30 min，于波長517 nm處測定吸光度，3次重復。以自由基清除率作為縱坐標，抗壞血酸濃度作為橫坐標制作標準曲線，用每克樣品中抗壞血酸含量（mg/g）來表示樣品結果。

式中：A0——空白的吸光度；

A1——100 μL抗壞血酸溶液+100 μL DPPH溶液的吸光度。

（2） ABTS法。 將7 mmol/L ABTS+溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液（體積比1∶1） 混合均勻，于室溫下過夜靜置得ABTS+溶液，利用無水乙醇進行稀釋，使其吸光度穩定在0.7±0.02。取樣品溶液和不同濃度梯度的抗壞血酸標準溶液100 μL于96孔板中，加入ABTS+溶液100 μL，混勻后反應10 min，于波長734 nm處測定吸光度，重復3次。以自由基清除率作為縱坐標，抗壞血酸濃度作為橫坐標制作標準曲線，以每克樣品干樣中抗壞血酸含量（mg/g）來表示樣品結果。

式中：A0——空白的吸光度；

A1——100 μL抗壞血酸溶液+100 μL ABTS+溶液的吸光度。

（3） 鐵離子抗氧化能力（FRAP） 法。取樣品溶液和不同濃度梯度的抗壞血酸溶液20 μL于96孔板中，加入FRAP溶液 100 μL混合，加入蒸餾水100 μL，充分混合后于37℃下水浴10 min，于波長593 nm處測定吸光度，3次重復。以吸光度作為縱坐標，抗壞血酸濃度為作為橫坐標制作標準曲線，以每克樣品干樣中抗壞血酸含量（mg/g） 來表示樣品結果。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

總酚、總黃酮及3種抗氧化活性檢測方法的線性范圍、線性方程和相關系數（R2） 見表1。

表1 總酚、總黃酮及3種抗氧化活性檢測方法的線性范圍、線性方程和相關系數 （R2）

各標準曲線分別在 0～120 μg/mL， 0～1 500 μg/mL，0～60 μg/mL， 0～120 μg/mL， 0～120 μg/mL 線性范圍內，相關系數（R2）均不小于0.980 8，線性關系良好。

2.2 不同提取劑對金柑多酚提取效果的影響

萃取物中總酚含量比較見圖1。

如圖1所示，不同極性溶劑對金柑多酚提取效果影響較大，各萃取物總酚的含量順序為正丁醇相＞乙酸乙酯相＞異戊醇相＞石油醚相。其中，正丁醇相金柑多酚的含量最高，為4.128 mg/g，而石油醚相多酚含量最低，僅有0.421 mg/g。根據趙謀明等人[15]研究發現，梨全果中的酚類物質含量為0.272～0.407 mg/g，柑橘總酚含量為0.406～1.694 mg/g，可以看出金柑多酚含量高于梨和柑橘的多酚含量。

2.3 不同提取劑對金柑總黃酮提取效果的影響

萃取物中總黃酮量比較見圖2。

如圖2所示，不同極性溶劑對金柑總黃酮提取效果影響較大。各萃取物總黃酮的含量順序為正丁醇相＞乙酸乙酯相＞異戊醇相＞石油醚相。其中，正丁醇相金柑總黃酮的含量最高，為2.073 mg/g，而石油醚相的總黃酮含量最低，僅有0.206 mg/g。

2.4 不同溶劑萃取物抗氧化活性測定

2.4.1 DPPH自由基清除法

DPPH法檢測金柑不同極性萃取物的抗氧化活性見圖3。

如圖3所示，不同極性溶劑萃取金柑對DPPH自由基清除的影響較大，各萃取物的對DPPH自由基清除順序為正丁醇相＞乙酸乙酯相＞異戊醇相＞石油醚相。其中，正丁醇相金柑抗氧化活性最好，每克樣品干樣中抗壞血酸含量達到3.058 mg/g，而石油醚相金柑抗氧化活性最低，每克樣品干樣中抗壞血酸含量僅有0.479 mg/g。

2.4.2 ABTS自由基清除法

ABTS法檢測金柑不同極性萃取物的抗氧化活性見圖4。

如圖4所示，不同極性溶劑萃取金柑對ABTS自由基清除的順序為正丁醇相＞乙酸乙酯相＞異戊醇相＞石油醚相。其中，正丁醇相金柑抗氧化活性最好，每1 g樣品干樣中抗壞血酸含量達到3.058 mg/g，而石油醚相的金柑抗氧化活性最低，每1 g樣品干樣中抗壞血酸含量僅有0.479 mg/g。

2.4.3 FRAP法

FRAP法檢測金柑不同極性萃取物的抗氧化活性見圖5。

如圖5所示，不同極性溶劑萃取對金柑多酚還原能力影響較大，順序為乙酸乙酯相＞正丁醇相＞異戊醇相＞石油醚相。其中，乙酸乙酯相金柑還原能力最好，每1 g樣品干樣中抗壞血酸含量達到5.100 mg/g，而石油醚相的還原能力最低，每1 g樣品干樣中抗壞血酸含量僅有0.231 mg/g。

綜上，金柑多酚提取物具有良好的抗氧活性，不同的抗氧化測定方法所得結果有所不同，DPPH法和ABTS法中抗氧化活性最好的是正丁醇相，而在FRAP法檢測中抗氧化活性最好的是乙酸乙酯相，造成這種差異的原因可能是不同萃取部位金柑多酚的組成成分不同。此外，多酚和黃酮含量越高其抗氧化活性也越好，表明多酚、類黃酮與抗氧化活性之間有良好的相關性。類似結果范祺等人[16]也有相關報道，表明葡萄中多酚、黃酮含量較高的品種，其抗氧化活性也較強。

3 結論

以金柑為原料，探究不同萃取劑種類對金柑提取物多酚提取效果的影響。結果表明，不同極性部位的總多酚和總黃酮含量差別較大，正丁醇相金柑總酚和總黃酮含量均最高，分別為4.128 mg/g和2.073 mg/g；以DPPH和ABTS自由基清除法分別測定不同金柑萃取物的自由基清除能力，結果表明正丁醇相金柑的抗氧化能力最強；而以FRAP法測定不同金柑萃取物的抗氧化活性，結果表明，乙酸乙酯相金柑的抗氧化能力最強。金柑萃取物抗氧化能力與金柑多酚含量有一定關系。