丹參二萜醌類活性成分通過PKCδ/PKD1μ 信號通路抗胰腺癌作用研究

葉曉鷗

目前，胰腺癌唯一的治愈手段為手術切除[1]，但由于患者確診時，體內常伴有胰腺癌細胞的浸潤和轉移，手術切除往往無法完全根治[2]。吉西他濱配合化療是胰腺癌的主要治療方式，但化療耐藥會阻礙吉西他濱發揮藥效[3]。在臨床上丹參二萜醌類被用來治療心血管疾病[4]，且其化合物能夠誘導腫瘤細胞的凋亡[5]。本研究觀察丹參二萜醌類化合物隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮抗胰腺癌AsPC-1，BxPC-3細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 胰腺癌AsPC-1 細胞、BxPC-3 細胞均采購于中科院上海細胞所。隱丹參酮（cryptotanshinone，CPT）分子式為C19H20O3，相對分子質量296.35，采購于Selleck（中國上海藍木化工有限公司）（批次S 228502）。丹參新酮（miltirone）分子式為C19H22O2，相對分子質量282.382，由浙江省中醫院中心實驗室尹一飛老師饋贈。去氫丹參新酮（dehydromiltirone）分子式為C19H20O2，相對分子質量280.367，由浙江省中醫院中心實驗室尹一飛老師饋贈。

1.2 細胞培養 胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細胞用含10% gibco 胎牛血清RPMI1640 培養液，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中常規培養。

1.3 CCK-8 法檢測細胞增殖能力 常規培養胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細胞，并按照不同濃度的隱丹參酮（0、5、10、15、30、50μM）、丹參新酮（0、5、10、15、20、30μM）、去氫丹參新酮（0、5、10、15、20、30μM）分別進行處理。加入CCK-8 并在培養箱中孵育后，檢測吸光度值（OD 值），并計算細胞存活率。

1.4 PI/Annexin-V 流式細胞術檢測細胞凋亡 按照AsPC-1 組和BxPC-3 組進行分組，組內分別設置有空白對照組、隱丹參酮組（30μM）、丹參新酮組（15μM）、去氫丹參新酮組（15μM），分別作用于對數生長期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細胞24h，經AnnexinV-FITC/PI 染色后，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5 Western blot 檢測PKC 同工酶磷酸化 隱丹參酮組（30μM）和空白對照組；丹參新酮組（15μM）和空白對照組；去氫丹參新酮組（15μM）和空白對照組分別作用于對數生長期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3細胞4h 后，收集細胞提取細胞總蛋白Western blot檢測PKC 信號通路相關位點的磷酸化水平。

1.6 SiRNA 轉染 對AsPC-1 和BxPC-3 細胞進行siRNA 轉染，以沉默PKCδ。轉染后siRNA 的陰性對照組為si-nc 組，成功沉默PKCδ thr505 位點的細胞設置為siRNA 組，并將未經任何處理的的細胞設置為空白組（con）。按照上述分組分別將處于對數期的細胞接種于6 孔板中于細胞培養箱中培養4h 后，收集細胞提取細胞總蛋白Western bloting 法檢測PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點的磷酸化情況。

1.7 統計學方法 應用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差表示，采用單因素方差分析及Dunnett t 檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮顯著抑制胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細胞增殖 不同濃度的隱丹參酮（0、5、10、15、30、50μM）、丹參新酮（0、5、10、15、20、30μM）、去氫丹參新酮（0、5、10、15、20、30μM）作用對數生長期的胰腺癌AsPC-1、BxPC-3、Panc-1、MIAPaCa-2 細胞24h 后CCK-8 法檢測細胞存活率。結果顯示，隱丹參酮濃度為30μM 時AsPC-1 細胞存活率為（40.1±5.0）%，BxPC-3 細胞存活率為（36.2±5.4）%，Panc-1 細胞存活率為（89.3±6.5）%，MIAPaCa-2 細胞存活率為（92.2±4.9）%；丹參新酮濃度為15μM 時AsPC-1 細胞存活率為（52.1±5.1）%，BxPC-3 細胞存活率為（47.2±5.7）%，Panc-1 細胞存活率為（95.3±5.5）%，MIAPaCa-2 細胞存活率為（93.2±5.9）%；去氫丹參新酮為15μM 時AsPC-1 細胞存活率為（46.1±5.0）%，BxPC-3 細胞存活率為（42.2±5.4）%，Panc-1 細胞存活率為（92.3±4.8）%，MIAPaCa-2 細胞存活率為（91.2±4.3）%。上述實驗結果表明，隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮對As－PC-1、BxPC-3 細胞增殖有明顯的抑制作用，且呈濃度及時間依賴性（P＜0.01）。

2.2 隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮顯著促進胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細胞凋亡發生 按照As－PC-1 組和BxPC-3 組進行分組，組內分別設置有空白對照組、隱丹參酮組（30μM）、丹參新酮組（15μM）、去氫丹參新酮組（15μM），分別作用于對數生長期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細胞24h，經AnnexinV-FITC/PI 染色后，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果顯示，空白對照組、隱丹參酮組、丹參新酮組、去氫丹參新酮組分別作用于對數生長期的胰腺癌AsPC-1 細胞24h，細胞的凋亡率分別為（4.6±3.4）%、（29.1±4.6）%、（50.3±7.1）%、（41.2±4.3）%；空白對照組、隱丹參酮組、丹參新酮組、去氫丹參新酮組分別作用于對數生長期的胰腺癌BxPC-3 細胞24h，細胞凋亡率分別為（5.3±4.8）%、（29.5±4.2）%、（32.1±5.4）%、（51.9±4.5）%。上述實驗結果表明，相對于空白對照組，隱丹參酮組、丹參新酮、去氫丹參新酮均能顯著促進胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細胞凋亡發生，且差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。

2.3 隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮顯著抑制胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細胞PKD1 ser916、PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點的磷酸化 隱丹參酮組（30μM）和空白對照組；丹參新酮組（15μM）和空白對照組；去氫丹參新酮組（15μM）和空白對照組分別作用于對數生長期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3細胞4h 后，收集細胞提取細胞總蛋白Western blot法檢測PKC 信號通路相關位點的磷酸化水平。結果顯示，隱丹參酮組、丹參新酮組、去氫丹參新酮組PKD1 ser916、PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點的磷酸化水平均下調，其它PKC 蛋白磷酸化水平未發生明顯變化（見圖1）。

2.4 隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮均能在1h內顯著抑制胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細胞PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點磷酸化 隱丹參酮組（30μM）、丹參新酮組（15μM）、去氫丹參新酮組（15μM）分別按照0、30min、1、2、4h 的時間梯度作用于對數生長期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細胞，收集細胞提取細胞總蛋白Western blot 法檢測PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點的磷酸化情況。結果顯示，隱丹參酮下調AsPC-1 細胞PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點磷酸化在作用2h 后效果顯著，對BxPC-3 細胞p-PKCδ thr505、p-PKD1 ser744/748 的下調作用則在30min～1h 時有明顯效果；丹參新酮、去氫丹參新酮則均能在1h 顯著抑制胰腺癌AsPC-1和BxPC-3 細胞PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點磷酸化（見圖2）。

2.5 SiRNA 沉默處理胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細胞PKCδ 后，PKD1 ser744/748 位點磷酸化水平明顯下調 對AsPC-1 和BxPC-3 細胞進行siRNA 轉染，以沉默PKCδ。轉染后siRNA 的陰性對照組為si-nc組，成功沉默PKCδ thr505 位點的細胞設置為siRNA 組，并將未經任何處理的細胞設置為空白組（con）。按照上述分組分別將處于對數期的細胞接種于6 孔板中于細胞培養箱中培養4h 后，收集細胞提取細胞總蛋白Western bloting 法檢測PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點的磷酸化水平。結果顯示，siRNA 沉默胰腺癌AsPC-1、BxPC-3 細胞PKCδ 后，胰腺癌AsPC-1、BxPC-3 細胞PKD/PKCμ ser744/748 的磷酸化水平下調（見圖3）。

圖1 Western blot 實驗檢測PKC 相關位點磷酸化水平

圖2 Western blot 檢測PKCδ 和PKD1 磷酸化水平

圖3 Western blot 檢測經過siRNA 轉染后AsPC-1、BxPC-3細胞PKC 相關位點磷酸化水平

3 討論

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是一組由單一多肽鏈組成的磷脂依賴性Ca2+激活的蛋白絲氨酸/蘇氨酸。前期實驗和文獻調研發現，PKC 在調控細胞增殖、分化、凋亡以及血管形成等諸多方面都起到重要作用，研究表明，PKC 能夠被具有促腫瘤增殖作用的佛波脂所激活，提示PKC 在腫瘤的增殖過程中可能起重要作用，因此被認為可能是腫瘤治療中的一個新靶點[6]。研究表明，PKCδ 特異性抑制劑能顯著性抑制胰腺癌Panc-l 和結腸癌HT29 細胞的腫瘤再增殖；PKCα 調節的肝癌細胞、乳腺癌細胞的侵襲轉移能力通過p38 信號通路介導[7]；PKCβII 選擇性抑制劑betalIV5-3 能夠減少人前列腺癌內皮細胞增殖和血管生成[8]；而PKCδ 的激活則引起促進腫瘤形成的SHH 信號通路及非經典的Writ 信號通路的活化[9]。

文獻報道，PKD/PKCμ SER916 位點可以作為監測PKD 活性的指標[10]，當p-PKD/PKCμ SER916 的表達受到抑制時，p-PKCδ thr505/p-PKD1 ser744/748 的表達會同時受到抑制。實驗結果顯示，隱丹參酮（30μM）、丹參新酮（15μM）、去氫丹參新酮（15μM）分別作用于胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細胞24h 后，p-PKD1 SER916 的水平均有下調，以此推測p-PKCδ thr505/p-PKD1 ser744/748 信號通路在該過程中發揮作用。后續實驗證明，p-PKCδ 水平受到抑制，并因此下調PKD1 ser744/748 的磷酸化。

綜上所述，隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮均能抑制p-PKCδ thr505 的表達，繼而p-PKD/PKCμ ser744/748 表達下調，從而顯著促進胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細胞凋亡發生。已有文獻報道PKD1 ser744/748 的磷酸化可以調控JNK 信號通路[11]，因此推測隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮通過調控PKD1-JNK 信號通路，抑制胰腺癌AsPC-1 和Bx－PC-3 細胞的增殖。