大米蛋白質酰胺Ⅲ帶三級紅外光譜研究

武玉潔,王麗欣,封卓帆,辛暢,肖霄,于宏偉

(1.河北一品制藥股份有限公司,河北 石家莊,052165;2.石家莊學院 化工學院,河北 石家莊,050035)

大米中含碳水化合物、蛋白質、脂肪,及豐富的B族維生素等,是我國南方大部分地區人民的主要食品[1-4]。大米富含蛋白質,而蛋白質的營養價值在很大程度和其結構有關。IR光譜是物質定性的重要方法之一。它的解析能夠提供許多關于官能團的信息。其定性分析有特征性高、分析時間短、不破壞試樣、測定方便等優點[5-8]。蛋白質在酰胺Ⅰ帶具有較強的紅外吸收峰[9-10],但由于酰胺Ⅰ帶和水分子的部分IR吸收峰重疊,因此影響了傳統的IR光譜在蛋白質結構的深入研究。而水分子在蛋白質酰胺Ⅲ帶吸收頻率附近沒有吸收峰,因此可采用IR光譜法測定大米酰胺Ⅲ帶研究蛋白質的結構[11]。由于蛋白質的酰胺Ⅲ帶的對應的官能團IR吸收強度不高,并不能提供有價值的光譜信息。2D-IR光譜是一項較為先進的IR光譜技術[12-13],本文采用2D-IR光譜,結合傳統的IR光譜及TD-IR光譜進一步開展食品(包括：玉米,小麥及食用酵母)蛋白質酰胺Ⅲ帶IR光譜研究工作[14-16],研究了溫度變化對大米蛋白質二級結構及熱穩定的影響,為大米的存貯及鑒別研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及操作方法

大米(產地：遼寧省盤錦市,石家莊市長安區北國超市談固店售);傅里葉紅外光譜儀(Spectrum 100型,美國PE公司);ATR-FTIR附件(Golden Gate型,英國Specac公司);ATR-FTIR變溫控件(WEST 6100+型,英國Specac公司)。

1.2 紅外光譜數據獲得及圖形處理

大米IR光譜實驗以空氣為背景,每次對于信號進行8次掃描累加;大米TD-IR光譜測溫范圍293～393 K(變溫步長10 K)。大米IR光譜和TD-IR光譜數據采用Spectrum v 6.3.5軟件,大米2D-IR光譜數據獲得采用TD Versin 4.2軟件。

2 結果與分析

2.1 大米IR光譜研究

大米的一維IR光譜如圖1A所示。由圖1A可知,3 283 cm-1頻率處對應的吸收峰是大米OH伸縮振動模式(νOH-one-dimensional-rice),2 925 cm-1頻率處對應的吸收峰是大米CH2不對稱伸縮振動模式(νasCH2-one-dimensional-rice),2 855 cm-1頻率處對應的吸收峰是大米CH2對稱伸縮振動模式(νsCH2-one-dimensional-rice),1 745cm-1頻率處對應的吸收峰是大米油脂C=O伸縮振動模式(νC=O-one-dimensional-rice),1 539 cm-1頻率處對應的吸收峰是大米蛋白質酰胺Ⅱ帶模式(νamide-Ⅱ-one-dimensional-rice), 而 1 240 cm-1頻率處對應的吸收峰是大米蛋白質酰胺Ⅲ帶模式(νamide-Ⅲ-one-dimensional-rice)。大米的二階導數IR光譜如圖1B所示。由圖1B可知,其譜圖分辨能力有了一定 的 提 高 , 其 中 1 660 cm-1(νamide-Ⅰ-1-secondderivative-rice)和 1 649 cm-1(νamide-Ⅰ-2-second derivative-rice)頻率處對應的吸收峰是大米蛋白質酰胺Ⅰ帶模式(νamide-Ⅰ-second derivative-rice), 而大米νamide-Ⅱ-rice 對應吸收頻率包括：1 548 cm-1(νamide-Ⅱ-1-second derivative-rice)、1 515 cm-1(νamide-Ⅱ-2-second derivative-rice), 相關 IR 光譜數據見表1。

表1 大米的IR光譜數據(303 K)

圖1 大米IR光譜(303 K)

2.2 大米蛋白質酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice的TD-IR光譜研究

首先開展了大米蛋白質酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-one-dimensional-rice的一維TD-IR光譜研究(圖2A)。由圖2A可知,隨著測定溫度的升高,大米νamide-Ⅲ-one-dimensiona-rice對應的吸收頻率出現了紅移,而相應的吸收強度明顯降低。進一步開展了大米蛋白質酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-second derivative-rice 的 二 階導數TD-IR光譜研究(圖2B),其光譜信息比較復雜。由圖2B可知,在303～393K的 加 熱 過 程 中 , 大 米 νamide-Ⅲ-secondderivative-rice出現了新的紅外吸收峰,相關TD-IR光譜信息見表2。大米蛋白質酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice的TD-IR光譜實驗則進一步證明,大米的蛋白質二級結構對于溫度變化比較敏感,而隨著測定溫度的升高,大米的蛋白質微觀結構發生改變。

表2 大米蛋白質酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice的TD-IR光譜數據(303～393 K)

圖2 大米蛋白質酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-riceTD-IR光譜(303～393 K)

2.3 大米蛋白質酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice的2D-IR光譜研究

2.3.1 同步2D-IR光譜研究

在1 200～1 330 cm-1頻率范圍內,首先開展了大米蛋白質酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice的同步2D-IR光譜研究(圖3),其譜圖分辨能力要優于相應的一維及二階導數IR光譜。首先在(1 214 cm-1,1 214 cm-1)、(1 270 cm-1,1 270 cm-1)、(1 289 cm-1,1 289 cm-1)和(1 306 cm-1,1 306 cm-1)頻率處發現了4個相對強度較大的自動峰。1 214 cm-1頻率處的吸收峰歸屬于大米蛋白質二級結構中的β-折疊結構[14-16],1 270 cm-1頻率處的吸收峰歸屬于大米蛋白質二級結構中的無規卷曲結構,1 289 cm-1頻率處的吸收峰歸屬于大米蛋白質二級結構中的β-轉角結構,而1 306 cm-1頻率處的吸收峰歸屬于大米蛋白質二級結構中的α-螺旋結構。大米νamide-Ⅲ-rice同步二維紅外光譜自動峰數據則證明：大米蛋白質二級結構中的β-折疊結構(1 214 cm-1)、無規卷曲結構(1 270 cm-1)、β-轉角結構(1 289 cm-1)和α-螺旋結構(1 306 cm-1)對應的官能團對于溫度變化比較敏感。此外在(1 214 cm-1,1 306 cm-1)和(1 270 cm-1,1 289 cm-1)頻率處發現二個相對強度較大的交叉峰,則進一步證明大米蛋白質二級結構中,β-折疊結構(1 214 cm-1)和α-螺旋結構(1 306 cm-1)之間存在著較強的分子內相互作用,此外大米蛋白質二級結構中無規卷曲結構(1 270 cm-1)和β-轉角結構(1 289 cm-1)之間存也在著較強的分子內相互作用。

圖3 大米蛋白質酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice同步2D-IR光譜(1 200～1 330 cm-1)

2.3.2 異步2D-IR光譜研究

在1200～1330 cm-1頻率范圍內,進一步開展了大米蛋白質酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice異步2D-IR光譜研究(圖4),相關光譜數據及解釋見表3。

圖4 大米蛋白質酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice異步2D-IR光譜(1200～1330 cm-1)

表3 大米蛋白質酰胺Ⅲ帶νamide-Ⅲ-rice的2D-IR光譜數據及解釋

根據NODA原則[17-19]和表3數據可知,隨著測定溫度的升高,大米蛋白質二級結構紅外吸收峰變化快慢順序依次為：1 306 cm-1(α-螺旋結構)＞ 1 270 cm-1(無規卷曲結構)＞ 1 289 cm-1(β-轉角結構)＞ 1 214 cm-1(β-折疊結構)。研究結果說明,大米蛋白質二級結構中的α-螺旋結構對于溫度比較敏感,隨著溫度的升高,其結構最先被破壞,而大米蛋白質二級結構中的β-折疊結構則相對較為穩定。

3 結論

開展了大米蛋白質酰胺 Ⅲ 帶的三級紅外光譜研究。實驗發現：在1 200～1 330 cm-1頻率范圍內,大米蛋白質的二級結構主要包括：α-螺旋結構(1 306 cm-1)、無規卷曲結構(1 270 cm-1)、β-轉角結構(1 289 cm-1)和 β-折疊結構(1 214 cm-1)。隨著測定溫度的升高,大米蛋白質二級結構的微觀結構發生改變,其熱穩定性進一步降低。本文拓展了三級紅外光譜在大米蛋白質結構及熱穩定性的研究范圍,具有重要的理論研究價值。