外周血miR-27a、miR-29b聯(lián)合PSA檢測(cè)在診斷前列腺癌中的應(yīng)用

許賀春，成守金，王中良

（焦作煤業(yè)（集團(tuán)）有限責(zé)任公司中央醫(yī)院，1.檢驗(yàn)科；2.消化內(nèi)科，河南 焦作 454000）

前列腺癌（Prostate cancer，PC）是發(fā)生于男性前列腺的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。目前，PC的診斷主要依靠直腸指診、血清前列腺特異抗原（Prostate specific antigen，PSA）、盆腔 MR I檢查等[2]。PSA是由前列腺上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種具有組織特異性的絲氨酸蛋白酶，是PC的特異性標(biāo)志物，但無(wú)腫瘤特異性，在良性前列腺增生和前列腺炎中其水平也會(huì)升高[3]。尋找新的特異性高的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合診斷對(duì)提高PC的早期檢出率具有重要意義。miR-27a是前列腺集群調(diào)控反饋機(jī)制中的關(guān)鍵調(diào)控因子,可以調(diào)控前列腺癌的惡性生物學(xué)行為,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[4]。miR-29b是miR-29家族的一員，可以靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等相關(guān)基因的表達(dá)，參與多種腫瘤包括前列腺癌的發(fā)生發(fā)展[5]。因此，本研究檢測(cè)了PC患者外周血中miR-27a、miR-29b和PSA的表達(dá)，分析了其聯(lián)合檢測(cè)在PC診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2016年12月至2018年12月在本院確診的94例初診PC患者的血清標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理組織學(xué)確診，獲得患者及其家屬知情同意,通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重免疫系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾病；合并嚴(yán)重心、腦、肝、腎等臟器功能不全者；合并其他部位的原發(fā)腫瘤。94例PC患者，年齡40～80歲，平均年齡（56.66±9.37）歲，根據(jù)臨床病理分級(jí)：G1期 20 例，Gleason評(píng)分為 2～4分，G2期 28例，Gleason評(píng)分5～6分，G3期 46例，Gleason評(píng)分 7～10分；根據(jù)臨床TNM分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期38例，Ⅲ期11例，Ⅳ期15例。收集同期47例前列腺增生（Benign Prostatic Hyperplasia，BPH)患者的血清標(biāo)本為BPH組，年齡 40～80 歲，平均年齡（55.84±8.72）歲。 收集同期47例健康體檢者的血清標(biāo)本為對(duì)照組，年齡40～80 歲，平均年齡（56.24±9.18）歲。三組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 材料與儀器 Trizol總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購(gòu)自上海康朗生物科技有限公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；7500 RT-PCR系統(tǒng)購(gòu)自于美國(guó)Applied Biosystems；羅氏Elecsys E170電化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑購(gòu)自羅氏公司。

1.3 觀測(cè)指標(biāo) 所有納入研究對(duì)象于清晨采集空腹靜脈血3ml,3500rpm離心10min,分離上清。采用RT-PCR測(cè)定各組血清樣本中miR-27a和miR-29b的表達(dá)水平，采用Trizol試劑提取樣本的總RNA，用紫外分光光度儀測(cè)定RNA OD值，確定RNA濃度，將其稀釋到終濃度為1μg/μL，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參考已有文獻(xiàn)和研究[6,7]，設(shè)計(jì)反應(yīng)引物、條件和體系。miR-27a引物：正向5'-GGGTAGCACCATTTGAAATC-3'，反向 5'-TTTGGCACTAGCACATT-3'；miR-29b 引物：正向5'-GGCTTAGCTGCTTGTGAGCA-3'，反向5'-GCGGAACTTAGCCACTGTGA-3'，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以GAPDH作為內(nèi)參，采用循環(huán)閾值（Ct值）表示cDNA達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增所需的循環(huán)數(shù),計(jì)算△Ct值=目的基因Ct值-參照基因Ct值，將△Ct值轉(zhuǎn)化為表達(dá)量進(jìn)行比較。采用羅氏Elecsys E170電化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑檢測(cè)總前列腺特異抗原（tPSA）、游離前列腺特異抗原（fPSA）以及fPSA與tPSA的比值（f/tPSA）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，對(duì)計(jì)量資料首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),如果各組均滿(mǎn)足正態(tài)性且兩組間方差齊,采用單因素方差分析比較組間差異性;若以上條件不滿(mǎn)足則考慮非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)，且差異均以P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用ROC分析miR-27a、miR-29b聯(lián)合PSA診斷PC的價(jià)值，曲線(xiàn)下面積（AUC）表示診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 miR-27a、miR-29b在PC患者外周血中的表達(dá) 與對(duì)照組相比，BPH和PC患者外周血中miR-27a mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào) （P＜0.05），miR-29b mRNA的表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05）；與 BPH組相比，PC患者外周血中miR-27a mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），miR-29b mRNA 的表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)表 1。

表1 miR-27a、miR-29b在PC患者外周血中的含量（x±s）

2.2 PSA在PC患者外周血中的表達(dá) 與對(duì)照組相比，BPH和PC患者外周血中tPSA和fPSA的水平顯著升高(P<0.05),f/tPSA的水平顯著下降(P<0.05);與BPH組相比，PC患者外周血中tPSA和fPSA的水平顯著升高（P<0.05），f/tPSA的水平顯著下降（P<0.05），見(jiàn)表 2。

表2 前列腺癌患者PSA血液中含量（x±s）

2.3 miR-27a、miR-29b、PSA 在 PC 中的診斷價(jià)值ROC 分析顯示，miR-27a、miR-29b、tPSA、f/tPSA、tPSA聯(lián)合f/tPSA以及三者聯(lián)合診斷PC的AUC依次為 (0.816±0.032)、(0.792±0.032)、(0.837±0.027)、(0.833±0.027)、(0.882±0.022)、(0.958±0.013)，且三者聯(lián)合診斷的AUC顯著高于其單獨(dú)診斷的AUC（P<0.05），見(jiàn)圖 1、表 3。

3 討論

PC是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，與遺傳因素相關(guān),早期常無(wú)癥狀，臨床易出現(xiàn)漏診或誤診，早期診斷率較低[8]。目前，血清tPSA、fPSA是PC患者最主要的診斷篩選方法[9]。PSA是前列腺上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種激肽酶家族蛋白，在血清中主要以fPSA、與α1-抗糜蛋白酶結(jié)合形成的復(fù)合物（PSA-ACT）以及與α2-巨球蛋白酶結(jié)合形成的復(fù)合物三種形式存在,是診斷PC的首選標(biāo)志物[10]。在生理情況下，PSA在血清中水平極低，一旦前列腺組織受到刺激、損傷或發(fā)生病變,會(huì)釋放大量的PSA進(jìn)入血液中,主要以PSAACT的形式存在于血清中[11,12]。本研究中，PC患者血清tPSA和fPSA水平均顯著升高，f/tPSA顯著下降，且對(duì)PC患者均具有一定的診斷價(jià)值。王祺等[13]的研究顯示，tPSA、f/tPSA對(duì)PC具有較高的診斷價(jià)值，但其缺乏腫瘤組織特異性，不足以發(fā)現(xiàn)早期患者，與本研究結(jié)果基本一致，提示tPSA、f/tPSA可用于臨床PC的診斷,但其存在一定的局限性，尋找新的PC血清腫瘤標(biāo)志物，進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)對(duì)提高PC患者的早期診斷率具有重要意義。

圖1 miR-27a、miR-29b、PSA在PC中的診斷價(jià)值

表3 miR-27a、miR-29b、PSA在PC中的診斷ROC特征

miRNAs是一類(lèi)非編碼RNA，可以同時(shí)調(diào)控多種基因以及多條信號(hào)通路,在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。本研究檢測(cè)了miR-27a、miR-29b在PC患者外周血中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-27a的表達(dá)量顯著升高，miR-29b的表達(dá)量顯著下降，且均對(duì)PC具有一定的診斷價(jià)值。miR-27a是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的癌癥相關(guān)的miRNA,可通過(guò)負(fù)調(diào)控多種靶向基因發(fā)揮其生物學(xué)功能，參與乳腺癌、胰腺癌、PC等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[14,15]。Wan等[16]的研究表明，miR-27a可以作用于雄性激素和PC之間，參與PC的集群調(diào)控反饋機(jī)制，促進(jìn)PC細(xì)胞的快速增殖，有望作為PC早期診斷和治療的分子標(biāo)識(shí)物,與本研究結(jié)果基本一致，提示miR-27a在PC患者外周血中的異常高表達(dá)可作為其診斷標(biāo)識(shí)物。miR-29b為一種抑癌基因，在多種腫瘤組織中均表達(dá)量下降，可以參與機(jī)體的多條信號(hào)通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[17]。Zhu等[18]的研究顯示，miR-29b可以抑制多種癌基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，在PC的診斷中具有重要意義,與本研究結(jié)果基本一致，提示miR-29b在PC患者外周血中表達(dá)量降低可能與PC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，其表達(dá)量下降對(duì)PC具有一定的診斷價(jià)值，有望作為其治療的新靶點(diǎn)。本研究聯(lián)合miR-27a、miR-29b以及PSA診斷,發(fā)現(xiàn)其聯(lián)合診斷的AUC顯著高于其單獨(dú)診斷的AUC，提示聯(lián)合診斷可以顯著提高PC患者的診斷率，臨床在條件允許的情況下，可以采用聯(lián)合診斷的方法，一期提高其診斷率。

綜上所述，PC患者血清tPSA、fPSA和miR-27a水平均顯著升高，f/tPSA和miR-29b顯著下降，且其均對(duì)PC具有一定的診斷價(jià)值，miR-27a、miR-29b聯(lián)合PSA診斷可以顯著提高其診斷價(jià)值，有望作為其診斷和治療的標(biāo)識(shí)物。但miR-27a、miR-29b作用于PC的具體機(jī)制目前尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。本研究不足之處在于樣本數(shù)量較少，可能會(huì)對(duì)結(jié)果造成一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差，但本研究仍為PC的診斷和治療提供了新的理論依據(jù)。