應用16S rRNA基因序列分析鑒定從痰培養中分離的假肺炎鏈球菌

賴希希，蔡鵬威，王軍軍，屈平華

（1.福建省立金山醫院檢驗科，福建 福州 350028；2.廣東省中醫院檢驗醫學部，廣東 廣州 510006）

假肺炎鏈球菌 （S.pseudopneumoniae）是Arbique[1]等2004年命名的菌種。該菌是一種草綠色鏈球菌，屬于緩癥-口腔鏈球菌復合群，其在遺傳學上與肺炎鏈球菌十分接近，并因故而命名。在生物學特征上，假肺炎鏈球菌不含肺炎鏈球菌莢膜，不溶于膽汁,在5%CO2氣體環境中對奧普托辛（OP）紙片耐藥或不確定的敏感性，但在大氣中培養時敏感，可與肺炎鏈球菌進行鑒別[1]。我們最近通過痰涂片和質譜鑒定技術,確定了一例假肺炎鏈球菌的臨床感染，現報告如下。

1 病例摘要

患者，男，76歲，既往有心臟病和慢性阻塞性肺病病史。入院一周前不慎受涼，期間反復低熱，因突發胸悶、氣促、痰多而入院。入院檢查，血常規提示中性粒細胞升高，CRP（24.9mg/l）、PCT（0.1ng/ml）等炎癥指標升高，胸部CT提示肺部炎癥、肺結構改變，血氣分析：氧合低（60mmHg）、二氧化碳不高（40mmHg），聽診雙肺啰音明顯，診斷Ⅰ型呼吸衰竭、慢性阻塞性肺病急性加重、肺部感染明確，痰涂片革蘭陽性菌可見吞噬，鹽酸莫西沙星靜滴（0.4g）經驗性抗感染，吸氧，霧化治療。治療第二天，患者咳嗽、咳痰減輕，改口服鹽酸莫西沙星片（0.4g），痰培養結果為假肺炎鏈球菌，青霉素敏感，左氧氟沙星敏感，繼續目前抗感染方案。第四天，患者少許咳痰，無發熱，血象正常，停用抗生素。

2 細菌培養鑒定

深部痰標本接種哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力平板和麥康凱平板,放入37℃5%CO2孵育箱中培養24小時，原始痰涂片鏡檢為合格標本，其中多形WBC>25/LP，SEC<10/LP，大量革蘭陽性球菌，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排列的雙球菌，形似肺炎鏈球菌，且白細胞空泡內有菌體(見圖1)。痰培養結果為草綠色鏈球菌生長 （3+)，其菌落較干燥，與典型的肺炎鏈球菌的菌落形態存在差異（見圖2）。以配置0.5麥氏菌液涂布于綿羊血瓊脂平板，并將奧普托辛紙片置于平板的中心，分別放置在37℃5%CO2和大氣環境中孵育過夜。試驗結果顯示，CO2環境的抑菌圈直徑大小為15mm,大氣環境的抑菌圈直徑大小為25mm（見圖3）。對該菌進行了Vitek MS質譜鑒定,質譜鑒定結果顯示為假肺炎鏈球菌,可信度99.9%。為保證鑒定結果的準確性，我們還進行了16S rRNA基因測序鑒定。采用16S rRNA基因通用引物，27F（5'-AGA GTTT GATYMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTT GTTACGACT T-3'）進行PCR擴增，擴增產物進行測序，測序序列進行比對[2]，結果顯示該菌與肺炎鏈球菌的相似度99.63%,與假肺炎鏈球菌的相似度99.75%（見圖4）,與假肺炎鏈球菌的相似度更高，結合表型鑒定結果，可進一步確定分離株為假肺炎鏈球菌。藥敏試驗：VITEK2 GP68重復2次,且延長孵育時間至48h，但均未生長。手工藥敏,青霉素：35mm，萬古霉素：26mm，克林霉素：30mm，紅霉素：31mm，四素素：30mm，復方新諾明：21mm，苯唑西林：18mm，左旋氧氟沙星：25mm。

圖1 痰涂片鏡檢（1000倍）

圖2 痰培養的血平板生長狀況

圖3 OP試驗結果（左圖為CO2環境，右圖為大氣環境）

圖4 分離株的16S rRNA基因測序鑒定結果

3 討論

假肺炎鏈球菌最常見于呼吸道標本,與慢性阻塞性肺疾病和吸入性肺炎相關[3,4]，也可從血液[5]、腹水[5]、眼結膜[5,6]以及其他無菌部位分離出。假肺炎鏈球菌不含肺炎鏈球菌莢膜,不溶于膽汁，在5%CO2氣體環境中對奧普托辛（OP）紙片耐藥或不確定的敏感性，但在大氣中培養時敏感，可與肺炎鏈球菌進行鑒別,用基因探針和PCR擴增特征性基因溶肺鏈菌素基因(ply)和錳依賴性超氧化物歧化酶基因(sodA)均不能將其與肺炎鏈球菌鑒別開。經DN A-DNA同源性比較研究確定它是一個新種,命名為假肺炎鏈球菌[1]。假肺炎鏈球菌的抗菌素耐藥性已經被證實，并且比肺炎鏈球菌更耐藥[3,7,8]。回顧以往的報道，大部分的假肺炎鏈球菌對紅霉素、四環素和青霉素耐藥[3,5,7,8]。由于該菌的菌落為草綠色鏈球菌樣，易被臨床微生物檢驗工作者所忽視，故國內的臨床報道較為少見,臨床微生物工作者應提高對原始涂片的重視[9,10,11]，避免遺漏假肺炎鏈球菌的檢出，造成臨床診斷和病情預測偏差，日常工作中若懷疑有假肺炎鏈球菌時,可同時做5%CO2及大氣環境中OP試驗，作為簡便快速的初篩試驗。

近年來,隨著生物技術和分子生物學的不斷進步，細菌的分類鑒定已不再囿于傳統的物理形態、生理生化鑒定,而是進入到了分子基因水平[2,7,12,13]。基于細菌16S rRNA基因的PCR擴增與測序同國際公認的公共核酸序列數據庫比對,結合計算機的大數據分析，被證明是鑒定病原菌快速、有效、準確的方法[2,7,12]。與表型特征分類方法相比,16S rRNA基因序列測定在分析鑒定細菌進化過程、親緣性方面具有突出優勢,令人鼓舞的是目前絕大部分的原核生物細菌已被測定,日常一部分用表型方法鑒定有困難、不明確、不能培養、培養時間久或者難以培養的細菌，運用16S rRNA基因序列分析通常能進行準確地鑒定。16S rRNA基因序列分析不僅可用于分析臨床中出現的少見菌、疑難菌、新發傳染性細菌，甚至還可以初步鑒定細菌新種，這對于提高臨床微生物檢驗的能力和水平大有裨益[14]。本文通過這種基因測序分析法,結合表型及生化特征分析,成功地對這株假肺炎鏈球菌進行了鑒別。