急性心肌梗死患者外周血miR-126-5p表達與心肌損傷的相關性

馬淑慧，徐進

（河南省信陽市中心醫院檢驗科免疫室，河南 信陽 464000）

急性心肌梗死其基礎病變通常為冠狀動脈粥樣斑塊形成,在動脈粥樣斑塊形成過程中反復發生血栓形成、心肌細胞缺氧缺血損傷病理改變，最終導致冠脈完全阻塞發生心肌缺血壞死[1]。目前評估心肌損傷的實驗室指標有傳統血清學標志物如血清肌紅蛋白、肌酸激酶 （CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、心肌肌鈣蛋白（cT-nI/T）等，都是急性心肌梗死患者心肌損傷標志物,尤其是cTnI/T的使用被認為是金標準[2-4]。這些標志物均有其局限，如特異度低、在慢性腎病與充血性心力衰竭患者中也有高表達等。近來有研究報道，miRNAs在急性心肌梗死患者血內表達明顯升高,有望成為急性心肌梗死新型標志物[5]。miR-12 6-5p能夠通過對內皮細胞活化與白細胞轉運機制的調控影響血管內皮功能,可能參與了急性心肌梗死的心肌損傷過程[6]。本研究觀察急性心肌梗死患者外周血miR-126-5p及各主要心肌損傷標志物表達情況，分析患者外周血miR-126-5p表達與其心肌損傷的相關性,為未來急性心肌梗死患者心肌損傷的早期評估與治療提供新的標志物。

1 材料與方法

1.1 納入對象 選擇2018年2月至2019年8月期間我院收治的31例急性心肌梗死患者，為心肌梗死組；不穩定性心絞痛患者30例,為不穩定性心絞痛組；穩定性心絞痛患者30例,為穩定性心絞痛組；接受健康檢查的35例健康人,為健康對照組。急性心肌梗死患者符合 《急性心肌梗死診斷和治療指南》[7]中相關診斷標準；穩定型心絞痛患者符合《慢性穩定型心絞痛診斷和治療指南》[8]中相關診斷標準；不穩定型心絞痛患者符合《不穩定性心絞痛和非ST段抬高心肌梗死診斷與治療指南》[9]中相關診斷標準。健康對照組人群均為既往無心血管病史且經健康體檢證實為身體健康的人群。排除：⑴既往有心肌病、心力衰竭、急性心肌梗死、高血壓性心臟病、肥厚性心臟病等心臟病病史者；⑵合并肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤疾病者；⑶合并慢性或急性腎功能不全者；⑷既往接受腎臟移植替代治療者；⑸近期內有外傷史、出血史與重大手術治療史者；⑹合并自身免疫性疾病、骨骼肌損傷等患者；⑺合并肺部慢性疾病或身體嚴重感染者。本研究的實施獲得醫院倫理委員會批準同意，并簽署知情同意書。

1.2 一般資料 急性心肌梗死組患者男性19例，女性 12 例；年齡 40～70 歲,平均（58.25±5.12）歲；體質量 44～85kg，平均（60.24±8.59）kg。 不穩定性心絞痛組男性 18例,女性 12例；年齡 41～70歲,平均（59.11±6.02）歲；體質量 45～85kg，平均（61.02±8.61）kg。穩定型心絞痛組男性17例，女性13例；年齡 40～72 歲,平均（60.01±5.17）;體質量 44～86kg，平均（61.59±8.71）kg。 健康對照組男性 21例，女性14 例；年齡 39～71 歲，平均（59.69±5.45）歲；體質量45～84kg，平均（60.32±7.17）kg。 4 組納入者性別、年齡、體質量等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.3 主要儀器與試劑 CK、CK-MB、LDH、cTnI試劑盒生產商為貝克曼庫爾特公司。乙二胺四乙酸(EDTA)生產商為Sigma-aldrich公司、RNA逆轉錄試劑盒生產商為Takara公司、DEPC生產商為賽默飛世爾科技有限公司;生化儀生產商為貝克曼庫爾特公司、免疫測定儀生產商為貝克曼庫爾特公司；總RNA提取試劑（Trizol）生產商為青島捷世康生物科技有限公司;線蟲cel-mir-39生產商為英國biorbyt；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ生產商為日本Takara公司；實時聚合酶鏈反應儀生產商為美國Bio-rad公司。

1.4 測定方法

1.4.1 心肌損傷血清標志物含量測定 采集入組者晨起時空腹狀態下外周靜脈血,采集1管5mL血樣本至抗凝管內，1份5min血樣本至干燥管（非抗凝管）內，抗凝管內血樣本經處理得到血漿，非抗凝管內樣本經處理得到血清。采用酶法檢測CK、CK-MB、LDH水平。血清cTnI含量采用免疫比濁法測定。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.2 外周血miR-126-5p表達測定 ⑴血漿microRNA的提取：向血漿(250μl)內加入TRIzol 750 μl,振蕩混勻保證蛋白復合物被完全解離，振蕩前各樣品內加入線蟲cel-mir-39 50pm作為內部參照。混合物內加入氯仿200μl，充分振蕩室溫下靜置 10min，在 12000r/min、4℃，離心 10min，離心后取上清液,將離心后所得全部上清液(多少體積？)轉移至新的裝有3μl糖原+600μl異丙醇的試管內。將混合的溶液置于零下20℃條件下過夜。12000r/min、4℃離心10min，棄上清，用95%酒精溶液反復清洗沉淀物，后加入DEPC 10μl混勻備用。⑵測定血漿microRNA濃度:取1μl RNA樣品，核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度,測量并記錄A260，A260/A280，RNA濃度,對測量異常過高或過低的，再次測量并核對，剔除異常值，其他樣本存儲在-80℃環境下待檢（進行逆轉錄）。⑶多聚腺苷酸化及逆轉錄。⑷microRNA定量檢測：配備20μl反應體系,反應體系的配備：7.2μl ddH2O，10μl SYBR （Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit） （2X），0.4μl miRNA特異性引物的3，引物，0.4μl輔酶Q引物和2.0μl cDNA。使用實時聚合酶鏈反應儀進行miR-126-5p相對表達水平測定,聚合酶鏈反應條件：預變性：95℃，10s，1次循環；聚合酶鏈反應：95℃，10s，60℃，20s，39 次循環； 溶解：95℃，15s，60℃，60s，95℃，15s，1 次循環。

1.5 統計學方法 本文數據均采用SPSS 20.0軟件檢測分析，采用“χ2”檢驗、t檢驗，用“[n（%）]”表示計數資料，使用均數標準差“（x±s）”表示計量資料（全部數據均經正態分布檢驗），外周血miR126-5p相對表達與各心肌損傷標志物水平的相關性，采用雙變量Pearson直線相關檢驗，P＜0.05為兩組數據對比差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組血清CK、CK-MB、LDH、cTnI水平比較 4組中,血清 CK、CK-MB、LDH、cTnI水平由低至高依次為健康對照組人群、穩定性心絞痛組、不穩定性心絞痛組、急性心肌梗死組，健康對照組與穩定性心絞痛組各指標水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）；其他各組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表 1。

表 1 4 組血清 CK、CK-MB、LDH、cTnI水平比較（x±s）

2.2 4組血清miR-126-5p相對表達比較 4組中，血清miR-126-5p相對表達由低至高依次為健康對照組人群、穩定性心絞痛組、不穩定性心絞痛組、急性心肌梗死組，各組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表 2。

表2 4組血清miR-126-5p相對表達比較

2.3 外周血miR-126-5P相關表達與心肌損傷各標志物水平相關性分析 經雙變量Pearson相關性分析結果顯示,急性心肌梗死患者外周血miR-126-5p相對表達與患者血清各心肌損傷標志物水平均呈顯著正相關（r＞0，P＜0.05）。 提示外周血 miR-126-5p表達量可反映患者心肌損傷的程度。見表3。

表3 外周血miR-126-5P相關表達與心肌損傷各標志物水平相關性分析

3 討論

在發生缺氧缺血損傷時,心肌細胞內酶與相關結構分子會釋放到血液循環中,成為可以反映心肌損傷程度評估的標志物。CK、LDH、AST等是廣泛存在于心肌、骨骼肌細胞和平滑肌細胞中，在一定程度上可以用于判斷心肌損傷程度,但其特異性相對較差[12]。CK-MB與cTnI二者是心肌細胞重要分子,用于評估機體心肌損傷有著較好的特異度[13]。CK-MB是催化酶的一類,參與了心肌細胞的能量代謝；cTnI則是結構分子，是確保心肌細胞結構完整性的重要蛋白[14,15]。臨床應用顯示，測定上述心肌損傷標志物的水平可用于評價心肌損傷程度。本研究分析了健康對照者、冠心病不同病情發展者與急性心肌梗死患者發病期間心肌損傷血清學標志物水平表達,結果隨心肌缺血損傷嚴重程度升高，CK、CK-MB、LDH、cTnI血清水平表達明顯升高。

圖1 健康對照組cTnI正態性檢驗Q-Q圖

近幾年，隨著多組學研究的飛速發展，發現了眾多新疾病分子生物標志物。miRNAs是一類單鏈的、短的、非編碼蛋白RNA分子，經部分互補匹配至目的靶點3′非編碼區,來調節基因水平表達[18]。許多miRNAs已經被證實在細胞周期增殖、調控、存活、分化、轉移等過程中發揮重要作用。有研究證實，miR-126-5p通過對內皮細胞活化與白細胞轉運機制的調控影響血管內皮功能,可能參與了急性心肌梗死的心肌損傷過程[19]，急性心肌梗死患者的心肌損傷可能與miRNAs存在一定聯系。有研究報道，急性心肌梗死患者miR-126-5p表達水平較健康人群顯著升高,與疾病之間表現出明顯的相關性[20]。本研究結果顯示，4組中健康對照組外周血miR-126-5p相對表達最低，心肌缺血患者隨病情嚴重程度上升，miR-126-5p血水平越來越高，以急性心肌梗死組最顯著，且miR-126-5p相對表達水平與血液中上述心肌損傷標志物均呈正相關。提示外周血miR-126-5p表達的異常升高與心肌缺血損傷的嚴重程度相關；miR-126-5p表達可能作為一種新的標志物用于評估急性心肌梗死患者心肌損傷程度。本研究納入樣本量相對較小，結論可靠性還應在未來進一步展開大樣本的研究加以驗證。

綜上所述,急性心肌梗死患者外周血miR-126-5p表達與其心肌損傷明顯相關,在臨床診療實踐中可考慮將miR-126-5p表達用于評估和預測冠心病患者心肌損傷程度。