腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85分子結構及對傷寒沙門氏菌的抗菌機理

高玉榮，李大鵬，張鳳琴，宋俊梅

（巢湖學院化學與材料工程學院，安徽 合肥 238000）

隨著人們對食品安全的日益重視，開發新型無毒的生物防腐劑成為食品工業的重要發展方向之一[1-2]。乳酸菌細菌素是由乳酸菌通過代謝作用產生的對其他微生物具有抑制或殺滅作用的多肽或蛋白質，是目前國內外公認安全的生物防腐劑[3-5]。目前廣泛應用的乳酸菌細菌素是乳酸鏈球菌素，但由于其抗菌譜窄（只對部分革蘭氏陽性細菌有抗菌作用，對革蘭氏陰性細菌無抗菌作用），適用的pH值范圍較窄，限制了其在食品中的應用[6-7]。因此新型廣譜乳酸菌細菌素的研究和開發成為目前該領域的研究熱點。

乳酸菌細菌素一般只對同屬內或親緣關系較近的菌株有抑制作用，目前乳酸菌細菌素的抗菌機理是以革蘭氏陽性細菌為模式菌株，缺少對革蘭氏陰性細菌抗菌機理的研究[8-12]；除了乳酸鏈球菌素外，對其他乳酸菌細菌素抗菌機理的研究并不系統，這使得新型廣譜乳酸菌細菌素的開發及應用缺少理論支持。

國內外普遍應用于泡菜等蔬菜發酵中的腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides是公認安全的乳酸菌發酵劑[13]。目前國外已分離出少數產細菌素的Leuconostoc mesenteroides，如Héchard等[14]從羊奶中分離出一株Leuconostoc mesenteroides Y105，產生的細菌素mesentericin Y105分子質量為2.5～3.0 kDa；Maria等[15]從肉制品中篩選出一株Leuconostoc mesenteroides，產生的細菌素mesentericin B-TA33a分子質量為3.466 kDa。但目前發現的這些由Leuconostoc mesenteroides產生的細菌素只能抑制革蘭氏陽性細菌的生長。

本課題組前期從傳統發酵酸黃瓜中分離到一株產細菌素的腸膜明串珠菌Leuconstoc mesenteroides subsp. mesenteroides ZLG85，研究發現其產生的細菌素mesenterocin ZLG85是一種新型廣譜的乳酸菌細菌素，不僅對革蘭氏陽性細菌有抗菌作用，也對革蘭氏陰性細菌具有較強的抗菌作用，具有作為新型生物防腐劑的應用前景[16-17]。本研究擬以前期實驗發現的新型廣譜的細菌素mesenterocin ZLG85為對象，通過液相色譜-質譜聯用（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）、Edman降解法及圓二色光譜（circular dichroism，CD）對細菌素mesenterocin ZLG85的分子質量、氨基酸序列及二級結構進行解析，采用ProParam tool軟件對細菌素的理化性質進行分析；以傷寒沙門氏菌為模式菌株，通過對紫外吸收物質滲漏、轉膜電勢及細胞膜通透性的影響來探討細菌素mesenterocin ZLG85對傷寒沙門氏菌的抗菌機理，以期為新型廣譜乳酸菌細菌素的研究和開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

腸膜明串珠菌ZLG85分離自發酵酸黃瓜，美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）菌株編號為KF746910[16]。

傷寒沙門氏菌ATCC14028購買于中科院微生物研究所。

MRS培養基：魚肉蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、牛肉膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、檸檬酸銨2 g/L、三水乙酸鈉5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、結晶硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、吐溫-80 1 mL、碳酸鈣（粉）10 g/L、蒸餾水1 L，pH 6.5，121 ℃濕熱滅菌20 min。固體培養基則在此基礎上加入20 g/L的瓊脂。

營養肉湯培養基：魚肉蛋白胨20 g/L、酵母浸粉6 g/L、氯化鈉5 g/L、磷酸氫二鉀2.5 g/L、葡萄糖2.5 g/L、蒸餾水1 L，pH 6.5，121 ℃濕熱滅菌20 min。半固體（固體）培養基則在此基礎上加入7.5 g/L（20 g/L）的瓊脂。

1.2 儀器與設備

ABI 491型蛋白測序儀 美國應用生物系統公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；LS55熒光分光光度計 美國PerkinElmer公司；EPICS-XL流式細胞儀 美國BD公司；J500型CD儀 日本JASCO公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及液體培養

挑取腸膜明串珠菌ZLG85斜面保藏菌種1～2 環，接種于MRS固體斜面培養基上，30 ℃培養24 h。

挑取活化的斜面菌種1～2 環接種于裝有50 mL MRS液體培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃、100 r/min搖瓶培養24 h。

1.3.2 細菌素分離純化

將腸膜明串珠菌ZLG85的培養液，按照Gao Yurong等[18]的方法進行細菌素的分離純化，其中凝膠層析采用Sephadex G25進行，每步純化后計算各步驟的總活力、比活力、蛋白質量濃度、產量和純化倍數。其中：總活力（AU）是純化后所獲得樣品中細菌素的抗菌活力，是溶液中每毫升抗菌活力（AU/mL）與體積（mL）的乘積；比活力是樣品中每毫克蛋白所含的細菌素的活力單位，為一定體積純化樣品中抗菌活力（AU）與蛋白質量（mg）之比；蛋白質量濃度為1 mL細菌素樣品中的蛋白質量（mg）。產量為純化后的總活力與無細胞發酵液的總活力之比；純化倍數為純化后的細菌素樣品的比活力與無細胞發酵液的比活力之比。

1.3.3 細菌素分子質量及結構分析

1.3.3.1 細菌素Tris-Tricine SDS-PAGE及LC-MS/MS分析

采用Tris-Tricine十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），分離膠質量分數16.5%，濃縮膠質量分數5%。純化的細菌素和低分子質量Marker同時在140 V電泳4 h。結束后，將膠切成兩半，帶有Marker的一半采用考馬斯亮藍染色脫色，另一半用無菌蒸餾水漂洗1 h后，小心地鋪在接有指示菌的營養肉湯固體培養基上，30 ℃培養24 h后與染色的半塊膠對比，找到具有抗菌活性的條帶，即細菌素條帶。將此條帶轉印在聚偏氟乙烯膜上，采用考馬斯亮藍染色。將切割的細菌素條帶洗脫后進行LC-MS分析[19-20]。

1.3.3.2 細菌素氨基酸序列分析

將條帶切割后，用ABI 491型蛋白測序儀對細菌素進行測序。采用Clustal Omega program將細菌素多肽序列與NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）數據庫中的細菌素相比較[21]。

1.3.3.3 細菌素理化性質分析

使用ProParam tool（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）軟件對細菌素的理化性質進行分析[22]。

1.3.3.4 細菌素CD分析

將細菌素溶于10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）中，細菌素濃度為100 μmol/L，采用J500型CD儀在室溫下測定，掃描范圍180～260 nm，樣品池光徑1 mm，CD數據以平均殘基摩爾橢圓度（[θ]）表示，CD譜圖為4 次累加的平均結果。以設備自帶的軟件對CD實測譜圖進行平滑處理，使用Dichro Web（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml）進行數據在線處理分析[23]。

1.3.4 細菌素抗菌機理分析

1.3.4.1 細菌素對傷寒沙門氏菌細胞生長的影響

收集培養至對數生長期的傷寒沙門氏菌細胞，用無菌水調整細胞懸浮液濃度為107CFU/mL，向其中加入制備的細菌素樣品，使其終抗菌活力分別為40、80、160、320 AU/mL，30 ℃恒溫靜置培養16 h，以不添加細菌素的樣品為空白對照，采用平板計數法測定傷寒沙門氏菌的活菌數[24]。

1.3.4.2 細菌素對紫外吸收物質滲漏的影響

將傷寒沙門氏菌的過夜培養物6 000×g離心15 min，收集菌體，細胞用無菌水洗滌兩次，并重新懸浮在無菌水中，制成細胞懸浮液。在細胞懸浮液中添加純化的細菌素mesenterocin ZLG85，使細菌素終抗菌活力為160 AU/mL，然后在36 ℃處理0、20、40、60、80 min和100 min。用0.22 μm的微孔濾膜過濾后，采用紫外-可見分光光度計分別在260 nm和280 nm波長處測定無細胞上清液的光密度值，以用蒸餾水處理的樣品為空白對照。用處理一段時間后的上清液光密度值與初始光密度值的差值（ΔOD）來表示紫外吸收物質的滲漏程度[25]。

1.3.4.3 細菌素對轉膜電勢的影響

采用3,3’-二丙基-二碳菁碘化物（3,3’-dipropylthi adicarbocyanine iodide，DISC3(5)）作為檢測轉膜電勢（Δφ）的熒光探針。離心收集傷寒沙門氏菌細胞，用磷酸鹽-4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液（0.002 5 mol/L、pH 7.0）清洗，重新懸浮在相同的緩沖溶液中并添加0.1 m o l/L的葡萄糖。在細胞懸浮液中添加0.4 μmol/L的DISC3(5)混合后，分別添加0.1 μmol/L尼日利亞菌素、1 μmol/L纈氨霉素和終抗菌活力160 AU/mL的細菌素來測定細胞膜電勢的變化。以不添加任何物質的細胞懸浮液作為空白對照，采用熒光分光光度計來測定熒光值，激發波長和發射波長分別設定為622 nm和670 nm[9]。

1.3.4.4 流式細胞儀測定細胞通透性

處于對數期的10 mL OD600nm為0.8～1.0的傷寒沙門氏菌，6 000×g離心15 min收集菌體，用pH 6.5無菌磷酸緩沖溶液清洗兩次。用終抗菌活力160 AU/mL的mesenterocin ZLG85于37 ℃分別處理30 min和60 min后，6 000×g離心15 min收集菌體。以菌體懸浮在不含細菌素的純凈水中作為空白對照，以碘化丙啶（propidium iodide，PI）為染色劑，用流式細胞儀分析實驗樣品與對照樣品的PI熒光強度[26]。

1.4 數據統計與分析

所有實驗重復3 次，每次兩個重復樣品。采用SAS 8.1軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 細菌素分離純化及Tris-Tricine SDS-PAGE分析結果

表1 細菌素mesenterocin ZLG85的純化Table 1 Purification steps of mesenterocin ZLG85

由表1可以看出，最初的無細胞上清液經過乙醇抽提后，產量為90.2%，純化倍數達到10.87，說明乙醇提取細菌素產量損失較小，且純度有了較大的提高，適合細菌素的粗提。經過Sephadex G25凝膠層析，細菌素的損失較大，產量為57.8%，但純化倍數有較大幅度提高，純化倍數達25.37。經過Sp-FF快速流陽離子交換柱層析后，細菌素產量下降為42.6%，但純化倍數提高到52.10，比活力提高到5 775.28 AU/mg，可達到細菌素純化的要求。

從純化后的Tris-Tricine SDS-PAGE（圖1）分析可以看出，在2.5 kDa處出現明顯單一蛋白條帶，而且電泳后單一條帶對指示菌有明顯的抑制作用，形成了清晰的抑菌條帶，表明了2.5 kDa的條帶為抗菌肽，即mesenterocin ZLG85。

圖1 細菌素mesenterocin ZLG85的Tris-Tricine SDS-PAGEFig. 1 Tris-Tricine sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis of mesenterocin ZLG85

2.2 細菌素結構分析結果

2.2.1 Mesenterocin ZLG85的LC-MS分析結果

圖2 細菌素mesenterocinZLG85樣品液相色譜圖Fig. 2 Liquid chromatogram of mesenterocin ZLG85

圖3 細菌素mesenterocin ZLG85質譜圖Fig. 3 Mass spectrum of mesenterocin ZLG85

將細菌素mesenterocin ZLG85轉膜純化后進行了LC-MS分析，液相色譜圖（圖2）分析結果表明分離純化后細菌素mesenterocin ZLG85的純度為98.23%，質譜圖（圖3）結果表明細菌素mesenterocin ZLG85的準確分子質量為2 522.5 Da。

2.2.2 Mesenterocin ZLG85的氨基酸序列

采用Edman降解法，測定細菌素mesenterocin ZLG85的氨基酸序列為KYYGNGVGGCSGAKNNKGCWGWKS。從數據庫http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.Cgi中搜索，沒有得到與mesenterocin ZLG85相同序列的細菌素。mesenterocin ZLG85與divercin V41（CAA11804.1）的同源性為57%；與enterocin CRL35（AAQ95741.1）的同源性為58%；與mesentericin Y105（AAB25127.1）和Chain A（1CW6_A）同源性為67%。采用Clustal Omega program（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進行細菌素序列的同源性分析，結果見圖4。由Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides ZLG85產生的細菌素mesenterocin ZLG85是一種新型廣譜細菌素。

圖4 采用Clustal Omega軟件分析mesenterocinZLG85與其他細菌素的同源性Fig. 4 Alignment of amino acid sequences of mesenterocin ZLG85 with those of other reported bacteriocins using Clustal Omega program

2.2.3 Mesenterocin ZLG85的物理化學特性

在線軟件ProParam tool分析結果表明，細菌素mesenterocin ZLG85的氨基酸數為24；理論分子質量為2 521.81 Da；理論pI值為9.51；負電荷殘基總數為0，正電荷殘基總數為4；原子總數為338；脂肪氨基酸指數16.25，總平均親水性為－0.996；不穩定系數為16.47，根據多肽不穩定系數大于40則不穩定的標準可知該多肽是穩定的。

前期實驗對細菌素mesenterocin ZLG85的穩定性進行研究的結果表明，細菌素mesenterocin ZLG85具有較強的穩定性，pH 2.0～10.0范圍內，細菌素相對抗菌活性均在80%以上；121℃處理30 min后相對抗菌活性仍為93.77%。這與在線軟件分析結果相同。預測分子質量（2 521.81 Da）與實際分子質量（2 522.5 Da）誤差為0.28%，這些結果也說明在線軟件ProParam tool進行細菌素的理化性質預測具有很高的準確性。

2.2.4 Mesenterocin ZLG85的 CD分析結果

圖5 細菌素mesenterocin ZLG85的CD圖Fig. 5 CD spectrogram of mesenterocin ZLG85

表2 細菌素mesenterocin ZLG85二級結構Table 2 Secondary structure composition of mesenterocin ZLG85

圖5為用CD儀自帶的軟件進行平滑處理獲得的CD圖，表2為使用Dichro Web對數據進行在線分析得到細菌素mesenterocin ZLG85的二級結構相對含量。由圖5和表2可以看出，細菌素mesenterocin ZLG85的二級結構主要為反平行結構、β-折疊和無規卷曲，分別為32.70%、20.70%和36.40%。

2.3 Mesenterocin ZLG85對傷寒沙門氏菌的抗菌機理

2.3.1 Mesenterocin ZLG85對傷寒沙門氏菌細胞生長的影響

圖6 Mesenterocin ZLG85對傷寒沙門氏菌細胞生長的影響Fig. 6 Effect of mesenterocin ZLG85 on the growth of Salmonella typhi

由圖6可以看出，不添加細菌素的傷寒沙門氏菌，隨著培養時間的延長，活菌數顯著增加。當細菌素mesenterocin ZLG85抗菌活力為40 AU/mL時，傷寒沙門氏菌活菌數沒有顯著增加（P＞0.05），起到了抑制傷寒沙門氏菌生長的作用；當細菌素抗菌活力為80 AU/mL時，處理20 h后傷寒沙門氏菌活菌數顯著下降（P＜0.05），但下降值為1.6，致死率小于99%；當細菌素抗菌活力為160 AU/mL時，處理20 h后傷寒沙門氏菌活菌數顯著下降（P＜0.05），下降值為4.1，致死率大于99.99%，結果表明160 AU/mL的細菌素對傷寒沙門氏菌表現為殺菌作用。

2.3.2 Mesenterocin ZLG85對紫外吸收物質滲漏的影響

圖7 Mesenterocin ZLG85對傷寒沙門氏菌在260 nm and 280 nm波長處紫外吸收物質滲漏的影響Fig. 7 Effect of mesenterocin ZLG85 on the leakage of UV-absorbing materials at 260 and 280 nm from Salmonella typhi cells

核酸和蛋白質的最大吸收波長分別為260 nm和280 nm，因此常用這兩個波長下的光密度值表征核酸和蛋白的濃度。由圖7可以看出，當用mesenterocin ZLG85處理沙門氏菌40 min后，在260 nm和280 nm波長處的ΔOD值分別提高到0.469和0.495，而空白樣品僅提高到0.018和0.034。結果表明mesenterocin ZLG85導致了大量260 nm和280 nm波長處紫外吸收物質的滲漏。

2.3.3 Mesenterocin ZLG85對Δφ的影響

圖8 Mesenterocin ZLG85處理傷寒沙門氏菌后DISC3(5))熒光強度Fig. 8 Fluorescence absorption values of DISC3(5) in Salmonella typhi treated with mesenterocin ZLG85

采用熒光探針DISC3(5)來測定傷寒沙門氏菌的轉膜電勢Δφ。如果傷寒沙門氏菌細胞膜被破壞，將導致轉膜電勢Δφ的消散，使DISC3(5)釋放到培養基中，引起培養液中熒光強度的提高。添加valinomycin引起傷寒沙門氏菌轉膜電勢Δφ的消散。但添加nigericin后，傷寒沙門氏菌細胞能維持轉膜電勢。在添加細菌素mesenterocin ZLG85 10 min后，引起了傷寒沙門氏菌轉膜電勢快速和完全的耗散，耗散速率與valinomycin相當。這些結果表明細菌素mesenterocin ZLG85引起了傷寒沙門氏菌細胞轉膜電勢的耗散。這種變化與Moll等[27]報道的II類細菌素plantaricins EF和plantaricins JK對Lactobacillus plantarum965的作用方式相似。

2.3.4 Mesenterocin ZLG85對細胞膜通透性的影響

PI能與DNA結合產生熒光，用PI染色細胞則染料能通過細胞膜進入細胞內與DNA結合。MnX是平均熒光道數，MnX越大，表明進入細胞的PI越多，與遺傳物質DNA結合后熒光強度越大，細胞膜的損傷越大，細胞的通透性越高。由圖9可以看出，與不用細菌素作用的對照樣品相比，用160 AU/mL的細菌素mesenterocin ZLG85分別作用傷寒沙門氏菌30 min和60 min后，MnX從2.86分別提高到5.49和7.12。因此，用160 AU/mL的細菌素mesenterocin ZLG85作用沙門氏菌導致其細胞膜通透性的增大，形成了較大的孔隙。

圖9 Mesenterocin ZLG85作用傷寒沙門氏菌流式細胞儀分析結果Fig. 9 Flow cytometry analysis of Salmonella typhi treated with mesenterocin ZLG85

3 討 論

Mesenterocin ZLG85是從發酵黃瓜中分離出的腸膜明串珠菌Leuconstoc mesenteroides subsp.Mesenteroides ZLG85產生的細菌素，不僅能抑制革蘭氏陽性細菌，也能抑制某些革蘭氏陰性細菌，具有廣譜的抗菌活性[16-17]。本研究首先對細菌素進行了分離純化，并采用LC-MS測定其分子質量為2 522.5 Da；通過Edman降解法測定其氨基酸序列為KYYGNGVGGCSGAKNNKGCWGWKS。在數據庫http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.Cgi中未搜索到與之序列相同的細菌素，采用在線軟件C l u s t a l Omega program（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進行細菌素序列的同源性分析，結果表明腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85與mesentericin Y105（AAB25127.1）和Chain A（1CW6_A）的同源性最高，為67%，是一種新型細菌素。采用CD對腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85二級結構進行了解析，發現主要結構為反平行結構、β-折疊和無規卷曲。采用ProParam tool軟件分析細菌素mesenterocin ZLG85的理論PI值為9.51，且具有穩定性。

此外，實驗以傷寒沙門氏菌為模式菌株，采用紫外-可見分光光度計、熒光分光光度計和流式細胞儀，通過對紫外吸收物質滲漏、轉膜電勢及細胞膜通透性的影響探討腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85對革蘭氏陰性菌的抗菌機理。結果表明，腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85的主要作用部位是在目標菌的細胞膜上，其對傷寒沙門氏菌的抗菌機理是導致沙門氏菌在260 nm和280 nm波長處紫外吸收物質的大量滲漏和轉膜電勢Δφ的消散，并導致細胞膜通透性增大，形成孔洞，最終導致細胞死亡。腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85的這種作用機制與細菌素plantaricins EF和plantaricins JK[28]、bacteriocins ST194BZ和ST23LD[28]以及pentocin 31-1[29]對敏感菌的作用機制一致。

腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85不僅對革蘭氏陽性細菌有抑菌作用，而且對革蘭氏陰性細菌也有抑菌作用。細菌素作用的靶位點是細胞質膜，而革蘭氏陰性菌的細胞外膜作為屏障阻止細菌素對細胞質膜發揮抑菌作用。實驗結果表明腸膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85最終也可作用于傷寒沙門氏菌的細胞膜，引起膜的穿孔作用。在線軟件ProParam tool分析mesenterocin ZLG85是一種帶正電荷的抗菌肽，對革蘭氏陰性細菌的作用方式符合細胞膜損傷機理的假設[30]。細菌素mesenterocin ZLG85可能是通過靜電作用，作用于革蘭氏陰性細菌傷寒沙門氏菌細胞壁表面脂多糖的陰離子磷脂和磷酸基團，從而吸附到傷寒沙門氏菌細菌的表面，進而穿過細胞壁與細胞膜結合。Mesenterocin ZLG85疏水端可借助分子中連接結構的柔性插入到傷寒沙門氏菌的細胞膜中，并牽引其進入細胞膜，擾亂膜上脂質及蛋白質的排列秩序，多個細菌素聚合形成跨膜離子通道，導致大分子物質的流失，最終導致細胞死亡。