基于氣相色譜-質譜、液相色譜-質譜技術研究貯藏過程中灘羊肉脂肪代謝通路轉換

苑昱東，李子欣，羅瑞明*，劇 檸，尤麗琴

（寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021）

動物屠宰放血后機體死亡，而器官、組織的機能并沒有同時停止，細胞仍在進行各種生命活動[1-3]。由于機體呼吸與血液循環(huán)中斷，細胞內的各種需氧性生化反應停止，代謝與活體產生差異[4-6]。研究宰后代謝差異對了解動物宰后肉成熟機理、改進冷鮮肉加工貯運技術有著積極的指導作用。

目前，國內宰后代謝研究多集中于某個基因調控某個通路變化，如顏新春等[7]研究了動物脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）基因表達的調控，結果表明，生長激素能明顯抑制FAS mRNA的豐度，從而影響動物脂肪酸的沉積。胡洪等[8]研究了哺乳動物丙二酰輔酶A（coenzyme A，CoA）的調控與表達，結果表明，丙二酰CoA受多種酶影響，對脂肪酸合成及分解進行調控。以宰后細胞為特殊生命系統，研究當前組學技術可檢出的全部代謝的構成及相互作用鮮見報道。灘羊是寧夏優(yōu)勢特色畜種[9-11]，本實驗以灘羊冷卻肉肌細胞為研究對象，以代謝組學研究宰后代謝物變化及其通路轉換，揭示灘羊宰后細胞代謝動態(tài)演化及其通路轉換機制，為灘羊肉品質控制提供理論指導。

段艷等[12]采用速溶劑萃取-耦合溶劑輔助風味蒸發(fā)法/氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）/GC-嗅覺測量法分析德州扒雞風味化合物，共鑒定出73 種成分，其中醛類15 種、酮類8 種，這些風味物質是由脂肪酸反應生成的。王毅等[13]采用GC-MS研究了伊拉兔肉脂肪酸組成，結果表明，兔胴體內主要脂肪酸有19 種，且各部位脂肪酸含量差異不顯著，其中，棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、油酸的積累含量占總含量的77%。本實驗采用GC-MS、液相色譜-MS聯用（liquid chromatograph-MS，LC-MS）技術相結合研究宰后皮下脂肪0～4 ℃貯藏中可檢測出的全部代謝物、代謝通路，及其厭氧呼吸條件下的相互關系及聯動轉化，分析時間推移中代謝網絡變化。研究這些特性對了解灘羊肉的性質、改善肉品質，及指導冷鮮肉及其制品加工有著重要的作用。研究代謝途徑轉化的代謝機制對了解灘羊宰后代謝物與代謝酶種類、豐度變化、調控機理及小分子營養(yǎng)風味物質（或前體）生成提供科學依據，為冷鮮灘羊肉及其肉制品生產技術研發(fā)提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗的原料為現宰殺的鹽池灘羊（6 月齡，公羊，10～15 kg），采自寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司。

甲醇、吡啶、正己烷、O-甲基羥胺鹽酸鹽（純度97%）德國CNW公司；氯仿 國藥集團化學試劑有限公司；L-2-氯苯丙氨酸 上海恒創(chuàng)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）儀、ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；Triple TOF 5600高分辨MS儀 美國應用生物系統公司；Pegasus 4D全二維氣相色譜飛行時間MS聯用儀（comprehensive two-dimensional gas chromatography/timeof-flight MS，GC×GC-TOF-MS） 美國LECO公司；DB-5MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm） 美國J & W Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

采集在0～4 ℃、相對濕度85%條件下貯藏的灘羊背最長肌上部皮下脂肪400 mg，封裝于滅菌冷凍管中待用。采樣周期為4 d，即采樣時間點為貯藏0、4、8、12 d，每組樣本做8 個生物學平行[14]。

1.3.2 脂肪酸組成的測定

1.3.2.1 樣品前處理

采用GC-MS分析樣品前處理步驟：精密稱取30 mg/組樣本，放入1.5 mL的離心管中。依次加入兩顆小鋼珠，加入20 μL的內標（0.3 mg/mLL-2-氯-苯丙氨酸，甲醇配制）和600 μL預冷的甲醇-水溶液（4∶1，V/V），在－80 ℃冰箱中放置2 min。隨即放入研磨機中研磨（60 Hz、2 min），加入120 μL氯仿。再用冰水浴超聲提取10 min，4 ℃靜置10 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取300 μL的上清液裝入玻璃衍生瓶中。

采用LC-MS分析樣品前處理步驟：精確稱取30 mg/組樣本于1.5 mL離心管中，加入20 μL內標（0.3 mg/mLL-2-氯-苯丙氨酸，甲醇配制），加入400 μL甲醇-水溶液（4∶1，V/V）；加入兩顆小鋼珠，在－80 ℃冰箱中放置2 min后，放入研磨機中研磨（60 Hz、2 min）；冰水浴中超聲提取10 min；－20 ℃靜置30 min；4 ℃、13 000 r/min離心15 min，用注射器吸取150 μL上清液，使用0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后，轉移到LC進樣小瓶，－80 ℃保存。

1.3.2.2 GC-MS分析

采用GC×GC-TOF-MS儀進行GC-MS分析。GC條件：DB-5MS毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm），載氣為純度不小于99.999%的高純氦氣，流速1.0 mL/min，進樣口的溫度為260 ℃。進樣量1 μL，不分流進樣。

MS條件：電子轟擊離子源，離子源溫度220 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式，質量掃描范圍：m/z30～600。

1.3.2.3 LC-MS分析

LC條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：45 ℃；流動相：水（含體積分數0.1%甲酸）、乙腈（含體積分數0.1%甲酸）；流速：0.4 mL/min；進樣體積：5 μL。

MS條件：樣品質譜信號采集采用正負離子掃描模式。

1.4 數據處理與分析

將所得的數據導入SIMCA 14.0軟件包，先采用無監(jiān)督的主成分分析來觀察各樣本之間的總體分布和整個分析過程的穩(wěn)定性，后用有監(jiān)督的偏最小二乘法分析區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，找到組間的差異代謝物。為防止模型過擬合，采用7 次循環(huán)交互驗證和200 次響應排序檢驗的方法來考察模型的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 灘羊肉貯藏過程中與脂肪酸代謝相關的差異代謝物分析結果

采用GC-MS、LC-MS法篩選出灘羊肉貯藏過程中含有的飽和脂肪酸有花生酸、硬脂酸、棕櫚酸；n-3不飽和脂肪酸有二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）；n-6不飽和脂肪酸有花生四烯酸；n-9不飽和脂肪酸有油酸、反油酸，具體見表1、2。再結合差異代謝物平均表達量的變化在KEGG數據庫中尋找相關差異代謝通路，進行代謝通路差異對比分析。

表 1 采用GC-MS篩選的冷鮮灘羊脂肪在貯藏過程中主要差異代謝物種類及平均表達量變化Table 1 Changes in average expression of major differential metabolites during storage of mutton fat determined by GC-MS

表2 采用LC-MS篩選的冷鮮灘羊脂肪貯藏過程中主要差異代謝物種類及平均表達量變化Table 2 Changes in average expression of major differential metabolites during storage of mutton fat determined by LC-MS

2.2 代謝通路差異性對比分析

采用GC-MS技術篩選出冷鮮灘羊脂肪貯藏4 d和0 d、8 d和4 d、12 d和8 d的差異代謝通路分別為104、108、69 條，而采用LC-MS技術篩選出的結果分別為18、31、15 條。由通路數量的變化可以看出，宰后冷鮮灘羊脂肪貯藏過程中，代謝通路的數量與種類隨貯藏時間的延長呈現先增多后減少的趨勢。取部分重要的P值小于0.05的差異代謝通路制得表3、4。

表3 采用GC-MS技術得到的冷鮮灘羊脂肪貯藏過程中主要差異代謝通路值對比Table 3 Comparison of -values of major differential metabolism pathways during storage of mutton fat determined by GC-MS

表4 采用LC-MS技術得到的冷鮮灘羊脂肪貯藏過程中主要差異代謝通路值對比Table 4 Comparison of -values of major differential metabolism pathways during storage of mutton fat determined by LC-MS

由表3可知，有關糖代謝的通路在0～4 d內差異顯著，而氧化磷酸化通路則未表現活躍，有關脂肪酸生物合成的通路在此階段也差異不顯著，說明宰后機體內很快處于缺氧狀態(tài)，但細胞仍試圖維持其ATP和宰前活體一樣處于一個較高水平，機體利用糖酵解代替氧化磷酸化而提供ATP以及利用磷酸肌酸和ADP的轉化補充ATP，于是構成了一個宰后供能反應體系[15-21]。在4～8 d內，新增代謝通路主要集中在與脂肪酸、氨基酸的合成及降解的相關代謝通路上，如脂肪酸生物合成、部分氨基酸合成通路。如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路P值由4 d組與0 d組的1.83×10－1（P＞0.05）變?yōu)? d組與4 d組的2.12×10－6（P＜0.01），甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝在8 d組與4 d組時表現出明顯差異，其P值（P＝6.54×10－4＜0.01）較4 d組與0 d組的P值（P＝5.16×10－2＞0.05）有顯著變化（表4中未給出）。說明與第4天相比，部分氨基酸代謝通路、脂肪酸代謝通路在貯藏第8天時表達顯著。脂肪酸的生物合成通路在整個冷鮮貯藏12 d過程中僅在4～8 d活躍，這與差異代謝物中風味物質前體油酸、棕櫚酸、硬脂酸在8 d時出現一致。說明冷鮮貯藏至8 d時，與脂肪酸合成的相關代謝通路活性提高，在此期間產生大量風味前體物質[22-23]。

2.3 代謝通路演化分析結果

在冷鮮貯藏8 d時，脂肪酸生物合成通路、GnRH信號通路以及甘油磷脂代謝通路變得活躍。不飽和脂肪酸生物合成通路在整個冷鮮貯藏過程中亦呈現出由差異不顯著到差異顯著再到差異不顯著的變化過程。對照KEGG數據庫中有關脂肪酸合成、分解的代謝通路，將有關棕櫚酸、硬脂酸的合成總體路徑繪制成圖1。

圖1 脂肪酸生物合成通路中有關棕櫚酸、硬脂酸的合成路徑Fig. 1 Biosynthesis pathways of palmitic acid and stearic acid

再以棕櫚酸的具體合成為例，結合KEGG數據庫中相關信息繪制棕櫚酸合成路徑（圖2）。

由圖2和表1、2可以發(fā)現，由GC-MS、LC-MS結果篩選出的3-羥基丁酸、3-氧代十六烷酸分別為棕櫚酸合成過程中的兩個前體物質，其中3-羥基丁酸是由乙酰CoA及丙二酰CoA共同合成的。在0～4 d內，3-羥基丁酸被消耗，并在一系列酶（如脂肪酸合成酶、烯酰還原酶及β-酮酰基合成酶等）的催化作用下逐步合成為3-氧代十六烷酸，故在此時段內，3-羥基丁酸表達量下調，而3-氧代十六烷酸表達量上調，但此時并未轉化為棕櫚酸，所以棕櫚酸的相對含量無差異。隨后在4～8 d內，3-氧代十六烷酸的相對含量無差異，棕櫚酸的合成并沒有受其前體物質3-羥基丁酸表達量上調的影響，反而其相對含量下降。說明在4～8 d內，棕櫚酸氧化分解過程活躍，可能是由于此時段，組織主要由脂肪酸氧化分解供能所致；而3-羥基丁酸的上調并未直接影響3-氧代十六烷酸的相對含量，這一過程可能是此時段催化合成3-氧代十六烷酸的相關酶活性降低所致。

圖2 棕櫚酸合成路徑Fig. 2 Biosynthesis pathway of palmitic acid

因此，丙二酰CoA是脂肪酸合成中的關鍵物質，其在脂肪酸合成中作為重要的二碳單位提供者存在[24]。丙二酰CoA在脂肪酸合成過程中起關鍵作用，同時也是抑制脂肪酸氧化分解的物質[25-28]。脂肪酸β氧化路徑在4～8 d差異顯著，說明此時脂肪酸氧化相關的代謝方式占主導地位。因此，可以推測出丙二酰CoA此時的含量較之前有所減少，其來源主要是由乙酰CoA經乙酰CoA羧化酶的轉化，也間接說明了此時乙酰CoA羧化酶的活性降低。

而丙二酰CoA轉變?yōu)楸?[酰基-載體蛋白]后，分別經由不同酶催化生成棕櫚酸、硬脂酸等脂肪的載體蛋白。這說明，在冷鮮貯藏4～8 d時段，機體能量處于相對較低水平，此時多種氧代酰基合酶以及脂肪酸合成酶被激活，從而使得棕櫚酸、硬脂酸等脂肪酸合成通路開啟。此外，在冷鮮貯藏4～8 d時棕櫚油酸表達量上調，但棕櫚酸表達量下調，可以看出，雖然脂肪酸生物合成通路開啟，但由于在此時硬脂酰基載體蛋白去飽和酶與脂肪酸合成酶及脂肪酰基-[酰基-載體-蛋白質]硫酯酶的活性不同，硬脂酰基載體蛋白去飽和酶將十六烷-[酰基-載體蛋白]轉化為十六烯酰基-[酰基-載體蛋白]，從而進一步轉化成棕櫚油酸；這一假設過程也能解釋棕櫚酸表達量在4～8 d時下調的原因。

圖3 GnRH信號通路中脂肪酸的β氧化路徑Fig. 3 β-Oxidation pathway of fatty acids in the GnRH signaling pathway

GnRH信號通路中有關脂肪酸β氧化路徑繪制如圖3所示，其中，環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）對細胞許多代謝過程的調節(jié)是通過調節(jié)酶的活性來實現的[29-31]。在有ATP存在的條件下，cAMP通過蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）激活脂肪蛋白激酶，使脂肪水解關鍵酶——激素敏感性甘油三酯脂肪酶磷酸化而激活，從而促進脂肪水解為甘油和游離脂肪酸。而過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatorsactivated receptor α，PPAR-α）則在能量缺乏的條件下被激活，PPAR-α的激活是通過作用于脂肪酸，使其平均表達量上調，再結合、活化過氧化物酶體和線粒體脂肪酸β氧化的基因參與脂肪酸轉運，進一步促進脂肪酸的生成、利用和分解代謝。

經上述分析可知，與脂肪酸代謝的相關通路均在冷鮮貯藏8 d時變得活躍，原因可能是經過一段時間的冷鮮貯藏后，脂肪細胞外部環(huán)境發(fā)生變化，其能量水平較活體時較低，導致部分酶活性降低或失活而另一部分酶被激活，從而使得一部分代謝通路由無差異到差異顯著[32-34]。由圖1、2可知，脂肪酸生物合成通路中棕櫚酸和硬脂酸的合成路徑與GnRH信號通路中脂肪酸β氧化路徑同時開啟，又因在冷鮮貯藏8 d時，棕櫚酸、硬脂酸等差異代謝物平均表達量顯著下調，說明脂肪酸的合成要遠小于其發(fā)生β氧化的程度。說明在貯藏初期，脂肪酸合成通路并未表現出現差異，但有關棕櫚酸等脂肪酸合成的前體短碳鏈化合物的相對含量有所變化。

3 結 論

本研究采用GC-MS、LC-MS技術研究宰后脂肪細胞0～4 ℃貯藏中可檢測出的全部代謝物、代謝通路，從代謝層面了解了宰后代謝的整體變化情況。結果表明，兩種方法下測出的差異代謝物結果有互補作用，檢測出的差異代謝通路從宏觀角度反映出了宰后整個代謝趨勢的變化。糖酵解通路在0～4 d內活躍，這種現象反映了宰后機體立即進入無氧呼吸階段，組織內細胞還要維持正常能量代謝水平的這種應激機制。在4～8 d內，脂肪酸生物合成通路、GnRH信號通路開啟，乙酰CoA在乙酰CoA羧化酶的催化下轉換為丙二酰CoA，丙二酰CoA在脂肪酸生物合成通路的作用是二碳單位提供者，同時也起到抑制脂肪酸β氧化的作用，該酶將丙二酰CoA轉換為丙二酰-[酰基-載體蛋白]后又經多種氧代酰基酶及脂肪酸合成酶催化生成棕櫚酸、硬脂酸、油酸等風味前體物質。8 d后，大部分通路逐漸關閉、消失，此時直接調控代謝的酶已失去活性。這個由能量變化引起的代謝通路之間的轉換過程可以看作是宰后代謝通路的動態(tài)演化過程。由脂肪酸代謝產生的風味物質前體也隨代謝活動的開啟、活躍、消失這一演化過程而發(fā)生動態(tài)變化。