基于GO分析篩選Ⅰ期子宮內(nèi)膜癌差異表達基因的研究

寧昭芳，張亞男，李會影，周方圓，黃麗曉，陳 妍，陶 濤*，楊寶麗*

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000；2.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518000）

子宮內(nèi)膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤，子宮內(nèi)膜癌主要根據(jù)流行病學(xué)、臨床和內(nèi)分泌特征來分為Ⅰ型和Ⅱ型[1]。Ⅰ型癌癥通常有子宮內(nèi)膜樣組織學(xué)，II型癌癥是漿液性癌[2]。在我國，子宮內(nèi)膜癌死亡率約為20%[3]。子宮內(nèi)膜癌的5年生存率很高，但其發(fā)生率卻有上升的趨勢，所以了解子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生十分重要。

基因本體是一種基于社區(qū)的生物信息學(xué)資源，它利用本體來表示生物知識，提供有關(guān)基因產(chǎn)品功能的信息[4]。為此，我們對正常子宮內(nèi)膜和Ⅰ期子宮內(nèi)膜癌的基因的表達數(shù)據(jù)進行了綜合分析，以探討與增殖、遷移和凋亡相關(guān)基因的異常表達以及其對子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展的影響，可以為子宮內(nèi)膜癌的分子機制和發(fā)展新的靶向治療方法提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 生物信息分析軟件和免疫組化圖片分析軟件

生物信息學(xué)在線分析網(wǎng)站：GEO （Gene Expression Omnibus）： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo;http://www.geneontology.org，DAVID（The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery）：https://david.ncifcrf.gov/；病人預(yù)后圖片來源：GEPIA （http://gepia.cancer-pku.cn/）；免疫組化圖片獲取網(wǎng)站：HAP https://www.proteinatlas.org/；免疫組化圖片分析軟件：image-proplus6.0；免疫組化結(jié)果分析軟件：Grappad prism7。

1.2 子宮內(nèi)膜和Ⅰ期子宮內(nèi)膜癌差異性表達

從GEO數(shù)據(jù)庫中搜索了Ⅰ期的子宮內(nèi)膜癌和正常子宮組織的基因表達數(shù)據(jù)庫表達譜分析（GSE17025），從每個數(shù)據(jù)中提取確定數(shù)據(jù)：GEO登記號、作者、患者年齡、種族、病理分期。其中子宮內(nèi)膜癌80例，正常組織12例，子宮內(nèi)膜浸潤程度和浸潤深度分布不均（9例IAG 1，14例IAG 2，7例IAG 3，14例IBG 1，12例IBG 2，13例IBG 3，7例ICG 1，10例ICG 2，6例ICG 3）。利用上述案例中的數(shù)據(jù)GSE17025在GCBI在線實驗室進行差異分析選取符合（|fold change|＞1，|fold change|＜-1，P值＜0.05）的數(shù)據(jù)，分析出差異基因。

1.3 差異基因的功能分析和免疫組化

在DAVID分析網(wǎng)站上對分析出的差異基因進行功能分析，分別挑選出與增殖、遷移和凋亡三個功能相關(guān)的基因。再從這三組基因中鑒別出與這三個功能都有關(guān)的基因。從GEPIA中查找和子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后有意義的基因。在HAP中查找SIX1的三組正常子宮內(nèi)膜和三組子宮內(nèi)膜癌的免疫組化的圖片，利用免疫組化分析軟件image-proplus6.0分析相關(guān)基因正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌的SIX1表達情況，用Grappad prism7軟件分析免疫組化的結(jié)果數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

在GSE17025的案例中得到總基54676個，分析得到個12325差異基因。從這些差異基因中分析得到與增殖有關(guān)的165個基因，與遷移相關(guān)的127個基因，與凋亡相關(guān)的155個基因。分別對這三個相關(guān)功能的基因取交集，一共得到14個共性基因（見圖1），分別是：ERBB4、FAP、

DDIT4、IL10、CDK1、LEF1、PDK1、AKT1、SIX1、PSEN1、HN1、GAS6、BAX、CYR61。根據(jù)GEPIA提供的生存曲線我們篩選出與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）的三個基因：SIX1、BAX、LEF1，和病人的生存期成負相關(guān)的基因為SIX1。挑選出的六位患者的免疫組化圖片（見圖2，圖3）經(jīng)image-pro-plus6.0分析后的IOD值分別為：1.05、4.92、4.65、25.66、21.1、25.99,差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05（見圖4）。

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是子宮常見的惡性腫瘤，嚴重危害女性健康，近年來其發(fā)病率不斷升高。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制由很多因素引發(fā)如：微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、p53基因突變以及LKB1-AMPK-mTOR等通路的異常均可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展[5]。但其發(fā)病機制仍然存在很多問題有待解決，了解子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制可以為子宮內(nèi)內(nèi)膜癌的預(yù)防和治療提供方案。

本研究通過生物信息學(xué)軟件對芯片數(shù)據(jù)（GSE17025）進行分析，在12325個差異基因中篩選出三組與增殖、遷移和凋亡相關(guān)的基因，并篩選出了14個可能和子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的核心基因。根據(jù)GEPIA提供的生存曲線我們篩選出與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）三個基因。其中LEF1、BAX的高表達有利于預(yù)后，而SIX1的高表達則相反。

圖1 增殖、遷移和凋亡的基因交集結(jié)果

圖2 正常子宮內(nèi)膜癌SIX1的免疫組化結(jié)果 （圖片來自HAP網(wǎng)）

圖3 Ⅰ期子宮內(nèi)膜癌SIX1的免疫組化結(jié)果 （圖片來自HAP網(wǎng)）

圖4 SIX1免疫組化分析結(jié)果圖

SIX1是調(diào)節(jié)細胞增殖、存活、遷移和侵襲的一種轉(zhuǎn)錄因子[6]。它被認為是一種新的蛋白質(zhì)，因為不適當?shù)脑俦磉_導(dǎo)致動物模型和人類基因組的不穩(wěn)定、惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[6-7]。Xin X[8]的研究表明SIX1可能通過ERK和AKT介導(dǎo)的途徑促進子宮內(nèi)膜癌中癌細胞的生長。

BAX(即Bcl-2相關(guān)蛋白)是第一個被現(xiàn)的促凋亡蛋白家族成員，細胞凋亡過程中調(diào)控線粒體外膜的關(guān)鍵之一[9-10]。Mirakhor Samani S[11]的研究表明BAX在正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜增生組織和癌組織中表達，并且發(fā)現(xiàn)BAX低表達及Bcl-2/BAX比值高與惡性程度有關(guān)。

LEF1是一種轉(zhuǎn)錄因子，主要參與亞基β-信號通路和多個亞型的發(fā)生和發(fā)展。除了癌細胞的增殖和生存能力外，更重要的是，它是上皮細胞過渡的促進者，也是癌細胞遷移和侵襲的一種輔助因子[12]。已有文獻報道LEF1在人和小鼠子宮內(nèi)膜腫瘤中過度表達，與其在腺體增殖中發(fā)揮作用一致[13]。上述研究證明SIX1、BAX、LEF1在腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用，與本研究分析得到的結(jié)果一致，為子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生機制的實驗研究提供了可靠的參考方向

本研究中分析得到的結(jié)果，可能因為選擇的分析軟件不同而存在稍微的差異。本研究的結(jié)果還需要結(jié)合免疫組化，細胞分子實驗再進行驗證。