直接PCR法在口腔牙齦卟啉單胞菌檢測中的應用

谷變利，王娟萍，孔金玉，劉雅莉，張 灝，詹啟敏，高社干

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)是人類牙周炎重要的致病菌，已有研究表明其在口腔內的水平可預測疾病進展或活動性[1-2]。據報道，P.gingivalis與多種人類腫瘤密切相關，如口腔癌[3]、上消化道癌[4]、胰腺癌[5]等，以及心血管疾病、類風濕性關節炎、阿爾茲海默癥等口腔-消化道系統及其他系統性疾病相關[6-7]。食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)是食管癌主要的一個組織亞型。已報道P.gingivalis在食管癌組織中的陽性率顯著高于癌旁組織及正常食管黏膜組織，且P.gingivalis與食管癌細胞分化狀態、轉移以及患者生存率呈正相關[4]。2017年的研究顯示，P.gingivalis在上消化道各部位腫瘤組織中不均勻分布，從食管到賁門至胃呈上高下低的趨勢[8]。這些研究表明，P.gingivalis可能是食管癌的高危因素。河南是中國食管癌高發省，為了摸清食管鱗癌高危人群、癌前病變及食管癌患者中P.gingivalis感染的流行病學特點，大樣本量的流行病學調查活動勢在必行。因此，一種能夠簡便而又準確地檢測口腔P.gingivalis感染狀態的方法顯得十分必要。

目前，檢測P.gingivalis感染的方法主要有培養法及分子生物學方法等。培養法結果具有高度特異性，然而，該法缺乏敏感性，培養成功率低，且需要5～7 d時間[9]，因此不適于大規模分子流行病學篩查。PCR為代表的分子生物學方法目前已發展成熟，實時熒光定量PCR法更是廣泛用于定量檢測唾液、牙菌斑、舌背等新鮮來源樣本中的P.gingivalisDNA檢測[10-12]。一般地，大多數DNA檢測技術，需要對樣本進行基因組DNA抽提，或者經過裂解，釋放核酸，進行PCR擴增。然而，在核酸抽提過程中，樣本的管間轉移步驟容易造成DNA的少量丟失，而影響PCR定量結果[13]。裂解法釋放基因組DNA相對試劑盒法步驟簡便，但涉及加熱離心等多個步驟，在應用于大規模樣本檢測時就顯得操作繁瑣，且耗時費力。因此，本研究采用直接PCR法檢測100例體檢者口腔P.gingivalis，無核酸裂解抽提步驟，檢測的靈敏度與特異性與常用的裂解方法及試劑盒抽提方法對比驗證，探究直接PCR法快速篩查口腔中P.gingivalis的可行性。

直接PCR是一種無需基因組DNA抽提、純化及定量步驟，直接將樣本加入PCR體系的方法。該方法只需一步操作，可以避免抽提中造成的DNA丟失。直接PCR擴增在分子生物學領域的應用始于20世紀90年代。直接PCR目前常規應用于臨床樣本病毒和細菌等病原體的檢測，以及生物多樣性監測與物種鑒定[14-15]。直接PCR法的優勢在血液[16-17]、頭發[18]、指紋[19]、織物[20]及“觸摸 DNA(touch DNA)”[14]等類型來源樣本中已有報道。然而，直接PCR法用于快速檢測牙齦拭子中的P.gingivalisDNA卻鮮有報道。

因此，本研究采用Tris-EDTA緩沖液置換細胞保存液，不依賴任何核酸裂解液或抽提步驟，直接qPCR檢測口腔拭子中P.gingivalis16S rRNA編碼基因，以期為P.gingivalis及其他微生物大規模分子流行病學研究提供快速有效的篩查手段。

1 材料與方法

1.1 樣本收集2019年10月來我院體檢中心進行體檢的100例成年健康人(男性37例，女性63例)，年齡20～79 (50.8±17.1)歲。樣本排除標準為：①體檢當天有刷牙、飲水、進食等行為活動；②近1 a有牙周或口腔治療史；③近3個月口服過抗生素或非甾體類抗炎藥物；④懷孕；⑤牙齒總數少于20顆(至少有4顆磨牙)。樣本采集信息包括：年齡、性別、吸煙及飲酒狀態。本研究獲得河南科技大學第一附屬醫院倫理委員會批準及受試體檢人員的知情同意。

在體檢當天，采用iCleanhcy一次性口腔植絨拭子(深圳華晨陽科技有限公司)，于受試者口腔4個象限第二、三磨牙的牙齦處，用刷牙的力度，擦拭并旋轉拭子各3次，拭子放入采集管的保存液中，折斷手柄，密封，完成取樣。樣本檢測前，保存于4 ℃不超過1周。每人采集雙份拭子。

1.2 拭子處理及核酸裂解、基因組DNA抽提①對全部拭子統一做以下處理：蓋緊管蓋，漩渦震蕩混勻，將保存液從收集管中轉移至新的1.5 mL離心管中(AXYGEN，MCT-150-C)，做好標記；常溫下12 000 r·min-1離心10 min；棄上清(盡量棄除干凈)，同時避免損失沉淀物。②對其中100份沉淀物的處理：加入Tris-EDTA (10 mM tris,1 m EDTA,pH 8.0) 50 μL，旋渦震蕩，重懸沉淀物，常溫放置，直接用于qPCR。③對另一組100份中的50份沉淀物的處理：加入細胞裂解液 (#18LS11001,深圳亞能生物) 50 μL，輕彈或旋渦，以重懸沉淀物，放于金屬恒溫器，100 ℃加熱10 min；常溫下12 000 r·min-1離心10 min，取出靜置，上清用于qPCR。④對剩余50份沉淀物的處理，按照MicroElute Genomic DNA Kit(#D3096-02,OMEGA)說明書進行離心柱法核酸抽提。最后用30 μL經70 ℃預熱的Elution Buffer洗脫DNA，測定核酸質量與濃度，用于后續qPCR。

1.3 模擬陽性樣本進行標準品制備取已知P.gingivalis陰性個體的口腔拭子，經離心后(12 000 r·min-1，10 min)去除保存液，得到沉淀物，加入1 mL已知濃度(1×109IU·mL-1)的P.gingivalisATCC 33277菌液(本實驗室復蘇培養)至口腔拭子沉淀物中，重懸沉淀，混勻后12 000 r·min-1，離心10 min，棄凈上清；加入100 μL TE buffer，重懸混勻。按10倍比濃度梯度進行稀釋，得到一系列P.gingivalis濃度：107、106、105、104、103、102、101IU·mL-1，測試qPCR體系靈敏度，獨立重復實驗3次。Ct值 ( cycle threshold value) 用于評估每個樣本感染P.gingivalis的量。

1.4 qPCR擴增P.gingivalis特異性引物探針序列參考Kuboniwa M的文獻[10]，序列為：P.gingivalisforward,5’-ACCTTACCCGGGATTGAAATG-3’,P.gingivalisreverse,5’-CAACCATGCAGCACCTACATA-GAA-3’;P.gingivalisprobe,5’-FAMATGACTGATGGTGAAAA-CCGTCTTCCCTTC-TARMA-3’。引物和探針序列均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。對標準品及受測樣本進行qPCR擴增。PCR體系如下：AceQ PCR Probe Master Mix (Vazyme,Q112-03) 10 μL，10 μmoL正反向引物各0.5 μL，0.2 pmoL TaqMan 探針，2 μL溶解液/裂解的上清/50 ng DNA，補加DEPC水至總體積20 μL。以上體系加入八聯管，于BioRad CFX96TM實時PCR系統，按照95 ℃，10 min，40 個PCR 循環 (95 ℃，10 s； 60 ℃，60 s)的步驟進行擴增，利用CFX MaestroTM software軟件分析擴增結果。

2 結果

2.1 TE-直接qPCR體系靈敏度測試經TE-直接qPCR擴增，結果顯示，在1×107～1×103IU·mL-1濃度區間，標準曲線的線性關系良好，定量方程斜率為-3.521，R2=0.997，擴增效率為92.3%。Ct值在18～32(圖1)。故本研究建立的口腔拭子TaqMan 熒光定量PCR體系檢出P.gingivalis的靈敏度達1 000 IU·mL-1。定性檢測可判定Ct≥38為陰性，Ct<38為陽性。

2.2 TE-直接qPCR、裂解液-直接qPCR、拭子核酸抽提試劑盒-qPCR法檢測P.gingivalis結果確定了直接qPCR體系后，對100例口腔拭子采用TE-直接qPCR法進行P.gingivalis檢測，對另一組中的50例口腔拭子采用裂解液-直接qPCR檢測P.gingivalis。對剩余50例口腔拭子采用試劑盒-qPCR法檢測P.gingivalis。3種方法檢出P.gingivalis陽性率結果及分析見表1-2。統計學分析表明，TE-直接qPCR法與裂解液-直接qPCR法相比，及TE-直接qPCR法與試劑盒-qPCR法相比，檢出P.gingivalis無顯著差異(表1-2)。

A：口腔拭子牙齦卟啉單胞菌標準品擴增曲線；B：牙齦卟啉單胞菌標準曲線。圖1 直接PCR體系靈敏度

表1 TE-直接qPCR與裂解法-直接qPCR檢測P. gingivalis的結果對比

注：①χ2=0.045，P=0.832；②針對PCR陽性樣本；③配對樣本t檢驗，P=0.019；④Ct值的配對樣本t檢驗,P=0.019。

表2 TE-直接qPCR與核酸抽提試劑盒法-qPCR檢測P. gingivalis的結果對比

注：①χ2>0.999，P=1；②針對PCR陽性樣本；③配對樣本t檢驗，P=0.933；④兩種方法檢測Ct值的配對樣本t檢驗,P=0.907。

2.3 對比裂解液-直接qPCR檢測方法，評價TE-直接qPCR法在50例樣本中，裂解液-直接qPCR與TE-直接qPCR法共同檢出P.gingivalis陽性16例，陰性33例，一致率達98.0%；兩種方法在檢測陽性樣本Ct值及定量結果log10均值方面具有統計學差異，均為P=0.019。參考裂解液-直接qPCR方法，TE-直接qPCR法檢測P.gingivalis的靈敏度與特異性分別為94.1%和100%，兩種方法在定性檢測P.gingivalis上具有較高一致性(Kappa=0.954)(表3)。

2.4 對比試劑盒-qPCR檢測方法，評價TE-直接qPCR法在50例樣本中，試劑盒-qPCR與TE-直接qPCR兩種方法共同檢出陽性23例，陰性27例，檢測P.gingivalis一致率達100% ；兩種方法檢測陽性樣本Ct均值及定量結果log10均值均無統計學差異(P=0.907，P=0.933)。參考試劑盒-qPCR，TE-直接qPCR法檢測P.gingivalis的靈敏度與特異性均為100%，兩種方法高度一致，Kappa=1(表4)。

表3 對比裂解法-直接qPCR，TE-直接qPCR檢測P. gingivalis的性能評價

表4 對比試劑盒法-qPCR，TE-直接qPCR檢測P. gingivalis的性能評價

3 討論

本研究首次采用TE buffer結合直接qPCR法檢測口腔中P.gingivalis，其優越性在于能直接擴增樣本中細菌DNA，無需抽提或裂解釋放核酸步驟。據報道使用商業化的核酸抽提試劑盒抽提核酸時會丟失模板DNA，影響qPCR檢測結果。而采用直接qPCR法，能夠最有效地擴增模板，減少出錯或污染率。本研究方法為直接qPCR法，每個反應能檢測低至1 000 IU·mL-1的P.gingivalisDNA，對比裂解液-直接qPCR，本方法檢測P.gingivalis的靈敏度和特異性分別達到94.1%和100%。對比試劑盒-直接qPCR，本方法檢測P.gingivalis的靈敏度和特異性均達到100%，其檢測性能與兩種參比方法高度一致。此外，從樣本處理到定量PCR檢測結束只需1.5 h(裂解液-直接qPCR需2 h，試劑盒-qPCR法則需3.5 h)，大大縮短了實驗時間。

直接qPCR體系中，最重要的因素是穩定且高效的DNA聚合酶系統，可直接用于體液、組織的擴增；同時，達到對背景復雜或者低豐度模板DNA有良好擴增效果。TE buffer有保存穩定DNA的功能，用它溶解重懸口腔脫落細胞沉淀物，既不會影響直接qPCR反應，又能在一定程度上起到稀釋口腔雜質，穩定模板DNA的作用。因此，本研究采用TE buffer重懸樣本，選擇文獻已報道且廣泛應用的P.gingivalisATCC 33277特異引物探針[10]，使用穩定高效的AceQ PCR Probe Master Mix建立P.gingivalis的直接qPCR體系。采用陰性口腔拭子樣本，加入已知濃度的P.gingivalisATCC 33277菌液，模擬陽性樣本，進行定量標準品制備，測試直接qPCR反應體系的靈敏性。結果表明，該體系在復雜背景中擴增P.gingivalisDNA性能穩定且靈敏度高，能實現模板DNA的定量。因此，使用特異引物探針，采用TE-直接qPCR法快速靈敏地檢測口腔P.gingivalis應用價值巨大。

在對比實驗中，只有1例樣本結果不一致，即裂解法-直接qPCR檢出陽性而TE-直接qPCR檢測為陰性。作者采用TE-直接qPCR法，對這1例樣本重復檢測2次后，發現2次結果重復性較差(1次弱陽性，1次無擴增)。考慮到樣本為口腔拭子，采用的是免核酸抽提及免裂解步驟的直接qPCR方法檢測，對照裂解液-直接qPCR結果，推測這例樣本存在較低豐度的P.gingivalis，陰性結果可能是樣本中潛在的抑制物造成的。另外，TE-直接qPCR法與裂解法-直接qPCR在檢測P.gingivalis方面具有較好的一致性。但分析表明，這兩種方法在反映定量結果的Ct均值與log10均值方面，對比有差異，且均有統計學意義(P=0.019)。說明TE-直接qPCR法與裂解法-直接qPCR在定性檢測P.gingivalis上高度一致，但用于定量檢測P.gingivalis時，二者一致性較差。當然，本研究也具有一定的局限性。首先，沒有深入研究TE buffer的最佳使用體積。研究中，為了保持與裂解液體積一致，采用了50 μL的用量。眾所周知，不同個體，口腔脫落細胞的量并不一致，因此，在溶解脫落細胞沉淀物進行直接qPCR時，必定有最小及最大體積的使用界限。再者，本研究中涉及的樣本數量比較有限，也未對口腔中其他常見細菌，比如具核梭桿菌、產黑普氏菌等一些革蘭氏陽性菌等進行研究。

綜上所述，本研究首次建立了免核酸抽提的TE-直接qPCR法檢測口腔P.gingivalisDNA。該方法除了具有高靈敏性與特異性外，還容易操作，整個過程只需1.5 h。這一快速準確的實驗技術，可用于食管癌分子流行病學研究，并在大規模流行病學篩查方面具有潛在優勢。

(致謝：感謝崔天星、李智濤等人在技術方面答疑解惑，感謝蘭子君、劉其偉、許海軍等人在樣本收集中提供的幫助！)