牙齦卟啉單胞菌與PDCD4在食管鱗狀細胞癌中的表達及相關性

李若楠，劉怡文，劉雅莉，王立東，張 灝，詹啟敏，高社干

食管癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，亦是我國最高發的惡性腫瘤之一，其發病率居我國惡性腫瘤第六位，死亡率居第四位[1]。根據病理類型可以將食管癌分為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺狀細胞癌(esophageal adenoid cell carcinoma，EADC)兩種亞型。據國際癌癥研究機構估算，2012年約有45萬例食管癌病例，其中ESCC病例88%，EADC病例12%[2]。我國人口眾多且ESCC發病率高達95%以上，導致中國約占地球上所有ESCC病例的一半[3]。

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)是一種革蘭氏陰性厭氧菌，作為慢性牙周炎的主要病原體[4]，在長期作用下可改變口腔的微環境而促進腫瘤的發生[5]，數年前已有多項研究證實Pg與口腔鱗癌的發生密切相關[6-9]，近幾年有研究發現Pg與食管鱗癌的發生也存在相關性[10]。

PDCD4是控制細胞凋亡的重要因子，人類Pdcd4基因位于染色體10q24， 編碼485個氨基酸[11]，含有表示氨基端和羧基端核定位信號的基本區域，除了影響細胞程序性死亡外，還可以通過抑制蛋白翻譯的起始因子從而抑制腫瘤的發生、發展。已有研究表明Pdcd4在食管鱗狀細胞癌中表達明顯下調或缺失[12]。

為了進一步探究Pg和PDCD4在食管鱗癌中的表達和臨床意義以及兩者之間的關系，本研究通過免疫組織化學染色法，檢測Pg和PDCD4在食管鱗癌組織和癌旁正常組織中的表達情況，并分析其相關性及臨床意義和預后價值。

1 材料與方法

1.1 材料回顧性收集2016年2月至2017年3月在河南科技大學第一附屬醫院手術的30例食管鱗癌患者的癌組織標本和癌旁標本及基本臨床資料。其中男性20例，女性10例；年齡60歲以上22例，60歲以下8例；高分化2例，中分化10例，低分化18例；淋巴結轉移陽性12例，無轉移18例；浸潤深度侵及外膜25例，未侵及外膜5例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器Pg兔抗人單克隆抗體及兔單克隆抗體PDCD4均購自Abcam公司，免疫組化SP超敏試劑盒購自中杉金橋生物技術有限公司，DAB顯色試劑盒、0.01 mol·L-1檸檬酸抗原修復(pH 6.0)、PBS 磷酸鹽緩沖液均購自索萊寶生物科技有限公司，蘇木素染液、中性樹膠、蓋玻片購自邁新生物技術有限公司。修復方法選用微波爐抗原修復。

1.2.2 實驗步驟與方法所有組織標本經10%的福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，制成3 μm厚的玻片，放入烤箱1 h，二甲苯脫蠟，放入梯度酒精中進行水化，再將組織切片放入加熱過的檸檬酸抗原修復液中放入微波爐進行抗原修復，SP法免疫組化染色。染色步驟按照SP超敏試劑盒說明操作，DAB顯色、蘇木素襯染、梯度酒精脫水、中性樹膠封片固定。

1.2.3 免疫組化結果判讀根據組織切片胞漿及胞核著色的陽性細胞數和著色面積進行評分，在組織切片中隨機挑選5個高倍鏡視野觀察，對組織切片的染色強度和染色面積進行半定量分析。染色強度評分標準為：①0分，未著色，陰性；②1分，著色較弱，呈淺黃色，弱陽性；③2分，中性著色，呈棕黃色，中度陽性；④3分，著色較強，呈棕褐色，強陽性。染色面積評分標準為：①陽性細胞占0%～5%，0分；②陽性細胞占6%～25%，1分；③陽性細胞占25%～75%，2分；④陽性細胞占>75%，3分。免疫組化評分計算方法：染色強度×染色面積得總分，0～12分分別代表：①0分，陰性；②1～3分，弱陽性；③4-8分，中陽性；④9～12分，強陽性。本實驗將0分定義為陰性，1分及以上定為陽性。

1.3 統計學處理采用SPSS 23.0統計軟件對實驗數據進行分析，采用卡方檢驗對食管癌組織及癌旁正常組織中的PDCD4、Pg的表達率及其與臨床病理特征進行分析；采用Spearman相關分析對PDCD4和Pg的表達相關性進行分析；采用Kaplan-Meier方法對總生存期(overall survival,OS)結果進行生存分析；以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PDCD4免疫組化結果

PDCD4 蛋白在癌旁正常組織中以細胞核中呈不同染色程度的棕黃色顆粒為特點，少數位于細胞質，而在食管癌組織中細胞核著色明顯下降并有向細胞質中轉移的傾向(圖1)。PDCD4蛋白在30例鱗癌組織中12例陽性，18例陰性，陽性率為40%；在30例癌旁正常組織中全部陽性，陽性率100%。經卡方檢驗，P<0.05，差異有統計學意義，表明PDCD4在食管鱗癌組織中的表達量顯著低于癌旁正常組織(表1)。如圖1所示，在癌旁正常組織中PDCD4呈高表達，而在食管鱗癌組織中，PDCD4的表達明顯下降。

表1 PDCD4蛋白在食管鱗癌組織和相應癌旁組織中的表達陽性率(n=30) 例(%)

A：PDCD4在癌旁正常組織中陽性表達；B：PDCD4在食管鱗癌組織中陰性表達。圖1 PDCD4在食管鱗癌組織中表達(SP，×200)

2.2 Pg免疫組化結果

Pg蛋白在30例癌旁組織中6例陽性，24例陰性，陽性率為20%；在30例鱗癌組織中16例陽性，14例陰性，陽性率為53.3%，經卡方檢驗，P值為0，表明Pg在食管鱗癌組織中的表達量顯著高于癌旁正常組織，差異具有統計學意義(表2)。Pg蛋白呈棕黃色顆粒，主要定植于細胞胞漿中，如圖2所示，Pg蛋白在癌旁正常組織中呈低表達，在食管鱗癌組織中的表達明顯增強。

2.3 Pg和PDCD4表達的相關性

在Pg蛋白表達陽性的癌組織中未發現PDCD4陽性表達，而在Pg蛋白表達陰性的14例癌組織中，PDCD4陽性12例，陽性率達85.7%，經Spearman相關分析，r=-0.87，P<0.05，差異具有統計學意義，表明Pg與PDCD4在食管鱗癌組織的表達呈負相關(表3)。

表2 Pg蛋白在食管鱗癌組織和相應癌旁組織中的表達陽性率(n=30) 例(%)

A：Pg在癌旁正常組織中陰性表達；B：Pg在食管鱗癌組織中陽性表達。圖2 Pg在食管鱗癌組織中表達(SP，×200)

2.4 Pg和PDCD4的表達與食管鱗癌患者臨床病理特征的關系

統計學分析顯示，Pg和PDCD4的表達均與性別、年齡無統計學相關性(P>0.05)，與分化程度、淋巴結轉移、臨床分期有統計學相關性(P<0.05)。Pg在低分化組陽性率高，PDCD4在中、高分化組陽性率高；Pg在淋巴結陽性組表達率高，PDCD4在淋巴結陰性組中表達率高；臨床分期越晚，Pg的陽性率越高，而PDCD4的陽性率越低(表4)。

表3 PDCD4和Pg在ESCC組織中的表達陽性率 例(%)

表4 Pg和PDCD4的表達與食管鱗癌患者臨床病理特征的相關性 例(%)

2.5 Pg和PDCD4的表達與ESCC預后的關系

將ESCC患者生存時間定義為自手術日至死亡或最后一次隨訪時間，觀察Pg和PDCD4的表達與ESCC患者預后的關系。30例患者中3 a內死亡8例，總生存率為73.33%。Pg陽性的患者(16例)死亡7例，Pg陰性的患者(14例)死亡1例；PDCD4陽性的患者(12例)死亡1例，PDCD4陰性的患者(18例)死亡7例。經Kaplan-Meier分析顯示，Pg陽性組的總生存率(56.25%)較Pg陰性組(92.86%)低(P=0.021)，且差異有統計學意義；PDCD4陽性組的總生存率(91.67%)較PDCD4陰性組(61.11%)高(P=0.060)，表明PDCD4陽性與ESCC患者的生存期呈正相關的趨勢。

3 討論

眾所周知，Pg的感染是牙周炎的主要致病原因之一，Pg可在口腔中定植[13]，多年來已有多項研究證實了Pg感染與口腔鱗狀細胞癌的密切關系：2011年美國佛羅里達州的一項研究顯示，Pg在口腔鱗癌組織中的檢出率顯著高于正常牙齦組織(P<0.05)，且在低分化癌組織中的滴度更高，提示該細菌與口腔鱗狀細胞癌有潛在的聯系[6]；2012年紐約大學醫學院環境醫學系流行病學處的一項約涉及2萬人的大型前瞻性研究表明，由包括Pg在內的口腔微生物引起的牙周炎與口腔消化系統惡性腫瘤的死亡率密切相關(相對危險度RR=2.28，95% CI：1.17～4.45)，血清Pg表達率的增高與口腔消化系統惡性腫瘤死亡率的增加明顯相關，且在無明顯牙周病的健康受試者中也發現Pg與口腔消化系腫瘤的高死亡率相關(RR=2.25，95%CI=1.23～4.14)，Pg是與微生物相關的口腔腫瘤死亡風險的生物標志物[7]；2019年中國醫科大學口腔醫學院的一項研究發現，口腔鱗癌組織DNA水平與miR-21、c-Jun表達呈正相關，與PDCD4表達呈負相關；Pg可以促進miR-21表達增高，引起PDCD4表達下降，從而促進口腔鱗癌細胞的增殖[12]。

A：Pg陽性組的OS低于Pg陰性組；B：PDCD4陽性組的OS高于PDCD4陰性組。圖3 Pg和PDCD4的表達與ESCC患者3 a OS的關系

綜上，Pg感染導致PDCD4表達率下降促進口腔鱗癌發生，但目前尚無研究證實兩者在食管鱗癌中的相關性及作用機制。本研究結果表明，在食管鱗癌組織中，Pg的表達率增高，PDCD4的表達率下降；Pg陽性與ESCC患者的生存期呈顯著的負相關(P<0.05)，PDCD4陽性與ESCC患者的生存期呈現正相關的趨勢(P=0.060)。Pg表達率的增高、PDCD4表達率的下降，與食管鱗癌的低分化、淋巴結的轉移、預后不良有顯著的相關性(P<0.05)。因此，在食管鱗癌患者中，Pg的表達率增高，可能導致PDCD4的表達率下降，進而促進食管鱗癌的發生，可將Pg、PDCD4相結合作為評價ESCC惡性程度和預后的參考指標。