二甲雙胍介導(dǎo)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)抑制動脈粥樣硬化

王夏蕾，楊景達(dá)，魏 偉，沈菊連，陸 璐，呂昕儒，肖建平，薛偕華

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)科；3.福建省康復(fù)技術(shù)重點實驗室；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州 350003 )

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS) 是一種與血脂代謝異常相關(guān)的慢性炎癥性疾病，異常代謝的血脂遭巨噬細(xì)胞吞噬在炎癥因子的介導(dǎo)下侵入血管內(nèi)膜產(chǎn)生一系列病理生理過程，誘導(dǎo)血管纖維帽的生成，最終形成動脈粥樣斑塊[1]，因而調(diào)節(jié)血脂代謝在AS的防治中起著重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport，RCT)作為血脂代謝的主要途徑在穩(wěn)定異常血脂代謝方面發(fā)揮重要作用，是抗AS的潛在治療靶點。RCT是指將體內(nèi)異常代謝的血脂轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟代謝進(jìn)而排出體外的過程，其中肝X受體α(liver X receptor α，LXRα)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDLC)起著重要的作用[3]。二甲雙胍作為臨床廣泛治療2型糖尿病的藥物，除了可以降低血糖外，還能減輕體重、改善血脂和增強(qiáng)內(nèi)皮功能[4]，近來研究提示二甲雙胍具有抑制AS進(jìn)展的作用[5]，因此，我們推測二甲雙胍可能通過LXRα-ABCA1途徑調(diào)節(jié)RCT、改善血脂代謝而起到抗AS的作用。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立AS模型，探討二甲雙胍對AS的影響以及對RCT的分子調(diào)控作用，為二甲雙胍抗AS提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級ApoE-/-小鼠18只(8周齡，♂)，購于南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，動物許可證號為SCXK(蘇)2015-001，置于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室喂養(yǎng)，實驗過程均按國際動物保護(hù)和使用指南的規(guī)定。

1.2 藥物與試劑鹽酸二甲雙胍片(格華止)購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院藥劑科(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號H20023370)，用0.9% 生理鹽水溶解成濃度為26 g·L-1的二甲雙胍溶液。油紅O染料，血清T-CHO、TG、LDL-C、HDL-C檢測試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)，蘇木素染料，伊紅染料(Solarbio公司)，乳脂致動脈粥樣硬化飼料(21%脂肪，0.15%膽固醇，江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司，MD12015)。鼠單抗LXRα antibody(英國，Abcam，ab41902)、鼠單抗ABCA1 antibody(英國，Abcam，ab18180)，鼠單抗GAPDH antibody(Proteintech，60004-1-Ig)、羊抗小鼠IgG(Proteintech，SA00001-1)、羊抗兔IgG(Proteintech，SA00001-2)。

1.3 儀器小動物超聲影像系統(tǒng)(型號：Vevo 2100，加拿大)，冰凍切片機(jī)(LEICA CM1950，德國)，多功能酶標(biāo)儀(TECAN，infinite M200)，普通光學(xué)顯微鏡(LEICA，德國)，超低溫高速離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific)。

2 方法

2.1 分組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，剪鼠尾提取DNA鑒定基因型，鑒定為ApoE-/-的小鼠，予普通飲食喂養(yǎng)至12周齡，隨機(jī)分為對照組(NC組)、模型組(Model組)、二甲雙胍組(Met組)，每組6只。模型組與二甲雙胍組飼喂致AS飲食6周，建立AS小鼠模型。對照組持續(xù)飼喂普通飲食。每周固定時間稱取小鼠體質(zhì)量。

2.2 藥物干預(yù)及取材參考Ma 等[6]研究，二甲雙胍灌胃量為260 mg·kg-1，Model組給予相同體積的0.9% 生理鹽水灌胃，Met組給予二甲雙胍溶液灌胃。每天干預(yù)1次，持續(xù)灌胃6周。干預(yù)過程中每周稱量各組小鼠體質(zhì)量，干預(yù)末期超聲檢測小鼠腹主動脈管壁厚度，干預(yù)完成后進(jìn)行取材，取材前禁食12 h不禁水。

2.3 小動物超聲血管壁厚度測量1%～2%異氟烷氣體麻醉后，脫毛膏清理腹部的毛發(fā)，將小鼠仰臥位固定于操作臺上，同步記錄小鼠心電及呼吸的頻率，調(diào)整氣麻劑量使心率維持在300～400次/min。涂抹耦合劑，調(diào)整超聲探頭位置，探頭方向與小鼠長軸垂直，在腹部找到腹主動脈橫斷面后，緩慢轉(zhuǎn)動探頭使其與腹主動脈走向一致。連續(xù)采集10 s的動態(tài)圖像，使用圖像分析系統(tǒng)測量管壁厚度，每個圖像隨機(jī)選取3個部位進(jìn)行測量。

2.4 血清血脂水平檢測摘除眼球取血，室溫靜置2 h，血液出現(xiàn)分層且有無色透明液體析出時，將血樣置于超低溫高速離心機(jī)，4 ℃ 3 000 r·min-1離心10 min，吸取上層血清。按照總膽固醇(T-CHO)測定試劑盒說明書的要求加血清及標(biāo)準(zhǔn)品到96微孔板中，37 ℃孵育10 min，在波長510 nm處測定各孔的吸光度數(shù)值，按照說明書提供的公式計算血清中TC的濃度，每個樣本重復(fù)3次計算平均值。同樣的方法檢測血清TG、LDL、HDL濃度。

2.5 組織病理學(xué)觀察取肝臟于預(yù)冷的生理鹽水溶液中漂洗干凈，左葉修剪成1 cm×0.5 cm大小放入預(yù)冷的多聚甲醛中固定，梯度蔗糖脫水后行OCT包埋。剝離出胸腹主動脈，取腹主動脈包埋。冰凍切片機(jī)將組織切成厚度為15 μm的切片，PBS洗5 min 3次后，行蘇木精伊紅及油紅O染色。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取視野并采集圖像。

2.6 免疫蛋白印跡檢測肝臟LXRα、ABCA1蛋白表達(dá)組織中加入適量的裂解液，超聲研磨離心后提取蛋白上清液。BCA法檢測蛋白上清濃度，100 ℃水浴變性。配置不同濃度比例 的分離膠和濃縮膠，加樣完成后進(jìn)行電泳，根據(jù)Marker位置切取分子量對應(yīng)的條帶進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。之后用BSA封閉特異性位點，將膜分別與一抗GAPDH、LXRα、ABCA1中4 ℃過夜，二抗常溫?fù)u床1 h后ECL顯影。分析計算目的蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量如Fig 1所示，在高脂飲食前各組小鼠體質(zhì)量無差異，在Model和Met組飼喂6周高脂飲食后，體質(zhì)量均較NC組明顯升高。藥物干預(yù)后，Met組體質(zhì)量逐漸降低，與Model組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 1 ApoE-/- mouse body weight n=6)

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsModel group

3.2 小動物超聲動脈管壁厚度實驗鼠取材前進(jìn)行小動物超聲檢測腹主動脈血管壁厚度，結(jié)果見Fig 2、Tab 1，發(fā)現(xiàn)Model組小鼠的腹主動脈管壁厚度較NC組增厚(P<0.01)，二甲雙胍干預(yù)后，腹主動脈管壁厚度變薄(P<0.01)。

Tab 1 Comparison of ultrasound wall thickness

**P<0.01vsNC;##P<0.01vsmodel

3.3 血清血脂水平如Tab 2所示，與NC組比較，Model組的TC、TG、LDL水平升高(P<0.01)，HDL水平降低(P<0.01)；與Model組相比，Met組的TC、TG、LDL水平均有降低(P<0.01)，HDL水平升高(P<0.05)。

Fig 2 Longitudinal section schematic of animal ultrasound abdominal aorta

A:B-Mode; B:M-Mode

3.4 肝臟病理學(xué)改變肝臟HE染色和油紅O染色結(jié)果表明(Fig 3)，NC組肝臟組織結(jié)構(gòu)較為清晰，無脂肪變性，肝細(xì)胞排列緊密、規(guī)則，呈放射狀環(huán)繞在中央靜脈周圍；Model組肝小葉結(jié)構(gòu)不明顯，肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞水腫，油紅O染色可見肝細(xì)胞內(nèi)大量脂滴；Met組肝細(xì)胞排列稍有紊亂，肝組織輕度脂肪變性，可見細(xì)小脂滴。

3.5 血管病理學(xué)改變腹主動脈HE染色結(jié)果顯示(Fig 4)，NC組主動脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)平整且薄，Model組管壁增厚，主動脈內(nèi)膜不平整，斑塊向血管腔內(nèi)突出，Met組管壁較Model組變薄，且內(nèi)膜光滑。

3.6 肝臟膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)分子LXRα、ABCA1蛋白表達(dá)肝臟免疫蛋白印跡結(jié)果顯示，Model組LXRα、ABCA1蛋白表達(dá)較NC組降低，二甲雙胍干預(yù)后，肝臟膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LXRα、ABCA1表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示二甲雙胍能夠改善肝臟脂質(zhì)逆轉(zhuǎn)運(yùn)能力。見Fig 5。

4 討論

AS是一類累及全身大小動脈的慢性炎癥性病變，是所有心腦血管疾病的病變基礎(chǔ)，由于異常升高的血脂被清道夫受體識別及攝取，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇異常聚集，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成，纖維斑塊形成，最終導(dǎo)致AS[7]。ApoE-/-小鼠是較成熟的動脈粥樣硬化動物模型[8]。我們的研究也證實了異常升高的血脂與AS嚴(yán)重程度正相關(guān)，AS模型組小鼠血中TC、TG、LDL明顯升高且腹主動脈粥樣斑塊的形成程度較對照組嚴(yán)重。二甲雙胍作為一種從法國丁香中提取的胍衍生物，已被用作人類降糖藥物60多年，除此之外，二甲雙胍還可以用于治療癌癥、肥胖癥、非酒精性脂肪肝病、多囊卵巢綜合征和代謝綜合征等相關(guān)疾病[4]。近來研究表明，二甲雙胍應(yīng)用于抗AS方面的治療，具有調(diào)節(jié)血脂代謝和抗炎等作用[9-10]，但對肝臟RCT的分子機(jī)制影響未見報道。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠血中TC、TG、LDL明顯升高，且腹主動脈粥樣斑塊的形成程度較對照組嚴(yán)重，但二甲雙胍干預(yù)后小鼠血中TC、TG、LDL及腹主動脈粥樣斑塊的程度改善明顯，提示二甲雙胍有明顯的降血脂及抗AS作用。有研究報道二甲雙胍降血脂及抗AS作用可能是通過抑制HDLC糖基化，增加HDLC與膽固醇結(jié)合，促進(jìn)RCT實現(xiàn)的[11]。RCT過程是一種內(nèi)源性機(jī)制，膽固醇從肝外組織向肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)，通過膽汁排泄到糞便中，并維持膽固醇穩(wěn)態(tài)[12]。動物與人的研究中均表明，RCT受損可導(dǎo)致AS加速，反之，RCT加強(qiáng)可預(yù)防或減輕AS[13]。因此，增強(qiáng)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，對清除血液和外周組織過多的膽固醇，減輕甚至逆轉(zhuǎn)AS至關(guān)重要。本實驗通過HE染色和油紅O染色評價肝臟的脂質(zhì)累及的嚴(yán)重程度，證實了AS模型組小鼠高脂飲食喂養(yǎng)后肝臟脂質(zhì)沉積明顯嚴(yán)重于普通飲食喂養(yǎng)的對照組小鼠，且模型組外周血HDLC水平明顯低于對照組，二甲雙胍干預(yù)后ApoE-/-小鼠肝臟脂質(zhì)沉積程度明顯改善并且外周血中HDLC水平明顯升高，推測二甲雙胍通過升高HDLC啟動RCT從而改善肝臟脂質(zhì)沉積。

Fig 3 Liver histopathological staining(×100)

A: HE staining of liver tissues in ApoE-/-mice;B: Red O staining of liver tissues in ApoE-/-mice

Fig 4 HE staining of abdominal aorta in ApoE-/- mice(×400)

##P<0.01vsModel group;B: Protein expression of LXRα and ABCA1(relative to GAPDH)

Tab 2 Comparison of serum lipid

**P<0.01vsNC;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

在RCT過程中，膽固醇流出主要由細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1介導(dǎo)，并受LXR轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的[3]。LXR和ABCA1是調(diào)節(jié)膽固醇體內(nèi)平衡的重要因子，LXR通過上調(diào)ABCA1、磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、載脂蛋白等介導(dǎo)肝臟細(xì)胞膽固醇外流，將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸并加快其在腸道的吸收[14]。LXR具有α、β兩種亞型，LXRα在肝臟中表達(dá)最高并在肝臟中形成LXRα-ABCA1通路參與RCT及抗AS過程，越來越多的證據(jù)表明LXRα調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和炎癥，在抗AS中發(fā)揮重要作用[15]。研究顯示LXRα的活性增強(qiáng)，促進(jìn)斑塊巨噬細(xì)胞及肝臟中ABCA1介導(dǎo)的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，起到抑制AS的作用[16]。激活LXRs發(fā)現(xiàn)血漿HDL及肝臟內(nèi)ABCA1顯著升高，預(yù)防AS的進(jìn)一步進(jìn)展，表明LXRs-ABCA1介導(dǎo)的肝臟RCT可能是一種抗AS的潛在治療靶點[17-18]。本實驗通過二甲雙胍干預(yù)后檢測ApoE-/-小鼠肝臟的LXRα、ABCA1表達(dá)情況，結(jié)果顯示二甲雙胍干預(yù)后的小鼠肝臟LXRα、ABCA1表達(dá)明顯高于模型組。結(jié)合肝臟脂質(zhì)沉積及血中TC、TG、LDL、HDL水平，我們實驗明確了二甲雙胍可以通過促進(jìn)肝臟LXRɑ、ABCA1的表達(dá)增強(qiáng)HDL介導(dǎo)的RCT，增強(qiáng)肝臟清除體內(nèi)TC、TG、LDL能力，減輕肝臟脂質(zhì)沉積，從而延緩及治療動脈粥樣硬化。

綜上所述，本研究證實了二甲雙胍能夠通過促進(jìn)肝臟LXRɑ、ABCA1的表達(dá)增強(qiáng)HDL介導(dǎo)的RCT，減輕肝臟脂肪病變，降低血清血脂水平，從而延緩動脈粥樣硬化病變，為二甲雙胍降血脂及抗AS提供理論依據(jù)。