楊梅素體外抗 EV71 病毒作用的研究

李文淼，張 洋，王 偉

(中國海洋大學醫藥學院，海洋藥物教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是含有約7.4 kb大小單股正鏈RNA的RNA病毒，屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)的腸道病毒屬[1-2]。EV71是導致5歲以下兒童患手足口病的關鍵性病毒之一，可感染中樞神經系統，導致嚴重的危及生命的神經系統疾病，嚴重時可引起肌痙攣、肺水腫和心肺衰竭等并發癥[3]。人類(尤其是兒童)在感染了EV71之后容易引起嚴重的并發癥，發病速度快，死亡率高。據中國國家衛生和計劃生育委員會的數據顯示，2009～2017年，EV71在中國至少造成17 717 819人感染，3 509人死亡。但目前還沒有特別有效的治療EV71感染導致手足口病的藥物。目前只有一種防治手足口病的疫苗正式上市，但是尚未發現有效的抗病毒藥物面市。

楊梅素(myricetin)化學名稱為3，5，7，3′，4′，5′-六羥基黃酮，又名楊梅樹皮素、楊梅黃酮、楊梅酮，屬于黃酮類化合物，存在于殼斗科、豆科、報春花科、葡萄科、菊科等植物中。據報道，楊梅素具有很多不同的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗血栓、神經保護和抗炎作用[4]。楊梅素已被證明對多種病毒具有抑制活性，如抗小鼠白血病病毒和人類免疫缺陷病毒活性。楊梅素對HIV逆轉錄酶活性有明顯抑制作用，且細胞毒性較低[5]。楊梅素和黃芩苷通過影響ATP酶活性，在體外能夠有效地抑制了SARS冠狀病毒解旋酶蛋白，提示楊梅素和黃芩苷可能是SARS冠狀病毒的有效抑制劑[6]。由此可見，楊梅素具有開發成為新型抗病毒藥物的潛力。

但是目前為止，鮮有關于楊梅素抗 EV71 病毒活性的研究報道。因此，本研究探討了楊梅素是否具有抑制EV71病毒活性，并在此基礎上初步探究了楊梅素的體外抗EV71作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物 楊梅素(529-44-2)從陶素化工有限公司購買(中國上海)。鹽酸胍從Sigma公司購買(中國上海)。

1.1.2細胞和病毒 非洲綠猴腎上皮 Vero 細胞在培養基(MEM)中培養，RD細胞在高糖培養基(DMEM)中培養，添加10%胎牛血清(ExCell Bio，中國)，1%青霉素(100 kU·L-1)，1%鏈霉素(100 mg·L-1)，于37 ℃，5%CO2的細胞培養箱中培養。EV71病毒株BrCr-tr(GenBank號：AB204852.1)來源于中國科學院武漢病毒研究所。病毒在RD細胞中增殖，保存于-80 ℃冰箱，病毒滴度用空斑法和50%組織培養感染劑量法(TCID50)在Vero細胞中測定。

1.1.3試劑 堿性磷酸酶檢測試劑盒(P0321)、4%多聚甲醛(P0099)、5%結晶紫染色液(C0121)、5×蛋白上樣緩沖液(P0015L)、PMSF(ST505)、RIPA裂解液(P0013B)購從碧云天公司購買，胎牛血清(FSS500)從ExCell Bio公司購買，MEM(1994643)和DMEM 干粉(1931639)從 Gibco公司購買，0.25%胰酶-0.02%EDTA(C125C1)從新賽美生物科技有限公司購買，α-Tubulin(2125S)和β-Actin(3700S)從Cell Signalling Technology公司購買，VP1-EV71抗體(IT-016-007M1)從Inmune Technology Corp公司購買，RNA提取試劑盒(RN28)從Aidlab公司購買，一步法RT-PCR試劑盒(639504)從TaKaRa公司購買。

1.1.4儀器 Ⅱ級B2型生物安全柜(新加坡Esco公司)；CO2培養箱(上海力康公司)；酶標儀(蘇州奧盛公司)；蛋白電泳電轉設備(美國Bio-Rad公司)；倒置相差顯微鏡(日本 Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1楊梅素對細胞毒性的實驗 取Vero細胞(1×108個·L-1)種在96孔板中，至其長滿單層，維持液(基本培養基添加1%青霉素(100 kU·L-1)，1%鏈霉素(100 mg·L-1)和0.2%胰酶)，用維持液稀釋楊梅素(終濃度為200 μmol·L-1、100 μmol·L-1、50 μmol·L-1、25 μmol·L-1、12.5 μmol·L-1)，吸去原培養液，將各濃度楊梅素分別加入各孔，設有空白組。在5%CO2培養箱中培養48h，吸去維持液，用4%多聚甲醛固定15min，吸棄，再加入5%結晶紫染色液，37 ℃放置15 min，用自來水沖洗，晾干后用酶標儀測定A540nm值，細胞存活率=試驗組A540nm/陰性對照組A540nm×100%。以細胞存活率為50%的藥物濃度作為半數細胞毒性劑量(CC50)。

1.2.2CPE抑制實驗檢測楊梅素不同處理方式下對EV71的抑制作用 用“1.2.1”方法在96孔板中接種細胞并長滿單層。分為A、B、C 3組，按照3種不同方式分別加入不同濃度的楊梅素(20 μmol·L-1、10 μmol·L-1、5 μmol·L-1、2.5 μmol·L-1)。I組(Pre+virus)：預處理病毒。不同濃度的楊梅素與100TCID50的EV71病毒液在37 ℃培養箱中預先混合1h，隨后加入96孔板中，于37 ℃作用1 h，吸棄，加入維持液；Ⅱ組(Adsorption)：吸附時加藥。藥物與100TCID50EV71混合，隨后加入96孔板，于37 ℃作用1h，吸棄，加入維持液；Ⅲ組(Post-adsorption) ：吸附后加藥。在96孔板中加入100TCID50EV71，于37 ℃作用1 h，吸棄，加入含有藥物的維持液。每個濃度設有3個復孔，同時設有病毒對照組和空白組。按“1.2.1”方法檢測。細胞存活率=(試驗組A540nm- 病毒對照組A540nm)/(空白對照組A540nm-病毒對照組A540nm)×100%

1.2.3空斑實驗檢測楊梅素不同作用方式下對EV71的抑制作用 在12孔板中接種細胞并長滿單層。按照“1.2.1”中方法的3種不同方式分別加入楊梅素(20 μmol·L-1)；用不同濃度的楊梅素(20 μmol·L-1、10 μmol·L-1、5 μmol·L-1、2.5 μmol·L-1)37 ℃預處理病毒1 h，再于37 ℃作用1 h，吸棄，加入維持液。24 h后收取上清，同時設有陽性藥對照、病毒對照組和空白組。

將收取的上清稀釋10～106倍，于37 ℃吸附1 h，吸棄，每孔加入配制好的Overlay，待其凝固后，倒扣置于37 ℃培養箱中。待其出斑后，固定染色，用自來水沖洗，空斑計數。

1.2.4空斑減少實驗評價楊梅素的直接殺病毒作用 在12孔板中接種細胞并長滿單層，用不同濃度的楊梅素(50 μmol·L-1、 25 μmol·L-1、12.5 μmol·L-1)37 ℃預處理病毒1 h，于37 ℃作用1 h，吸棄，每孔加入2 mL配制好的Overlay，待其凝固后，倒扣置于37 ℃培養箱中。待其出斑后，固定染色，用自來水沖洗，空斑計數。

1.2.5Western blot 檢測楊梅素對VP1蛋白的抑制作用 在12孔板中接種細胞并長滿單層，按照“1.2.4”接種細胞方法的3種不同方式分別加入楊梅素(20 μmol·L-1)；用不同濃度的楊梅素(50 μmol·L-1、 25 μmol·L-1、12.5 μmol·L-1)37 ℃預處理病毒1 h，于37 ℃作用1 h，吸棄，加入維持液，同時設有陽性藥對照組、病毒對照組和空白組。4 h后吸棄，每孔加入50 μL細胞裂解液(800 μL RIPA裂解液、200 μL 5×蛋白上樣緩沖液和10 μL PMSF)，在冰上裂解15 min，轉移至EP管中，100 ℃下煮15 min，放置于-20 ℃冰箱中備用。

提取的蛋白用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，用于后續的SDS-PAGE電泳實驗。電泳完之后利用半干轉法轉移到NC膜上，用 5%的BSA 4 ℃封閉過夜，然后將膜與 1 ∶1 000 稀釋的VP1抗體封閉液，37 ℃孵育2 h。用 TBST 漂洗膜 3 次，每次 15 min。再將膜與含 1 ∶ 4 000 稀釋的二抗( sc2357CM，Santa Cruz 公司) 封閉液一起37 ℃孵育2 h。TBST 漂洗膜3次，每次15 min。用堿性磷酸酶檢測試劑盒顯色，拍照后Image J軟件處理圖像。

1.2.6實時熒光RT-PCR檢測楊梅素對VP1的mRNA表達的抑制作用 在6孔板中接種并長滿單層，用不同濃度的楊梅素(50 μmol·L-1、 25 μmol·L-1、12.5 μmol·L-1、6.25 μmol·L-1)37 ℃預處理病毒1 h，于37 ℃作用1 h，吸棄，加入維持液，同時設有陽性對照組、病毒對照組和空白組。6 h后用RNA提取試劑盒提取總RNA，在Nanodrop上測定濃度及純度。按照一步法RT-PCR試劑盒說明書，42 ℃ 5 min， 95 ℃ 10 s， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，在7500 Fast Real-Time PCR System上測定循環數，并計算2-ΔΔct。所用的引物序列為：EV71-VP1(Forward: 5′-GGAGATAGGGTGGCAGATG-3′；Reverse: 5′-CCAATTTCAGCGGCTTGGAG-3′); β-actin(Forward: 5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′；Reverse: 5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′)。

1.2.7統計學分析 數據分析及繪制統計圖表均采用GraphPad Prism 6.0統計軟件。數據用表示，各組數據先進行正態性和方差齊性檢驗，采用t檢驗比較兩組之間的差異。

2 結果

2.1 楊梅素的細胞毒性實驗由Fig 1可見，楊梅素在最低濃度(12.5 μmol·L-1)處理時，Vero和RD細胞的存活率接近100%；濃度提高時，對Vero細胞的毒性會比RD細胞大些；在測試高濃度(200 μmol·L-1)時，Vero細胞存活率仍有50%，RD細胞仍有65%左右。經計算，楊梅素對Vero細胞的半數毒性濃度CC50為198.5 μmol·L-1，對RD細胞的CC50為217.2 μmol·L-1。

Fig 1 Determination of cytotoxicity of myricetin on

2.2 楊梅素對EV71的抑制實驗首先，將不同濃度的楊梅素(2.5～20 μmol·L-1)按照3種不同作用方式與100 TCID50的EV71相互作用，24 h后用觀察細胞病變程度，并利用結晶紫染色后測定A540nm值來計算細胞存活率。結果如Fig 2A所示，在Vero細胞中，預處理病毒(Pre+virus),吸附(Adsorption)和吸附后階段 (Post-adsorption) 加入楊梅素都能夠顯著提高EV71感染細胞的存活率，其CPE抑制作用呈現明顯的劑量依賴性。此外，在RD細胞內，預處理病毒和吸附階段加入楊梅素也能夠顯著抑制 EV71 的感染，并具有濃度依賴性，吸附后作用效果略差一些(Fig 2B)。

其次，在EV71感染24 h后收集細胞上清液，利用空斑實驗檢測病毒滴度來進一步評價楊梅素對于病毒增殖的抑制作用(Fig 3)。Fig 3A的結果表明，與病毒組相比，預處理病毒組(20 μmol·L-1)、吸附時加藥組(20 μmol·L-1)、吸附后加藥組(20 μmol·L-1)，分別將病毒滴度降低了2.56、2.08和0.9 個Log(PFU·mL-1)(P值分別為0.0154、0.0313、0.1633)。

最后，研究還發現楊梅素在20 μmol·L-1、10 μmol·L-1、5 μmol·L-1和2.5 μmol·L-1的濃度下分別將病毒滴度降低了2.78、1.92、1.18和0.11 個Log(PFU·mL-1)，(P值分別0.0039、0.0436、0.0992、0.7965)(Fig 3B)。而鹽酸胍(1 mmol·L-1)將病毒滴度降低了2.43個Log(PFU·mL-1)(P值為0.0146)。總之，以上結果說明楊梅素在5～20 μmol·L-1濃度下能夠顯著抑制 EV71 病毒增殖，且預處理病毒和吸附時加藥的抑制作用更顯著，說明楊梅素可能與病毒有直接相互作用。見Fig 2、Tab 1、Fig 3。

Tab 1 Inhibitory effects of myricetin on Vero and

2.3 空斑減少實驗評價楊梅素的直接抗病毒作用上述研究結果表明楊梅素可能與病毒有直接作用，因此我們繼續用空斑減少實驗來評價楊梅素的直接抗病毒作用。首先將不同濃度的楊梅素按照預處理病毒的方式與100 TCID50的EV71在37 ℃作用1 h后，在Vero細胞吸附1 h后利用空斑試驗直接檢測。結果如Fig 4所示，楊梅素對EV71有直接的抑制作用，且呈劑量依賴性；在50 μmol·L-1的濃度下，幾乎完全抑制病毒感染，在25 μmol·L-1的濃度下效果優于陽性對照鹽酸胍(1 mmol·L-1)的作用。因此，楊梅素在高濃度下有直接滅活病毒的作用，再次表明楊梅素能夠直接作用于EV71病毒顆粒。

2.4 楊梅素對EV71病毒蛋白表達的抑制作用我們又利用Western blot試驗評價了楊梅素對于病毒衣殼蛋白VP1蛋白表達的影響。結果如Fig 5A/C所示，相比病毒對照組(EV71)，楊梅素(20 μmol·L-1)預處理病毒和吸附時加藥都能夠顯著降低VP1的蛋白表達水平，而吸附后加藥也能夠減少VP1的表達，只是較預處理病毒和吸附時加藥組效果略差。其次，楊梅素在25 μmol·L-1和50 μmol·L-1濃度時能夠顯著抑制VP1蛋白的表達，但是12.5 μmol·L-1時抑制作用不明顯(Fig 5B/D)。

Fig 2 Inhibition of EV71 infection by myricetin in Vero and RD

Fig 3 Inhibition of myricetin onviral titer in EV71 infected Vero *P<0.05,**P<0.01 vs virus control.

Fig 4 Evaluation of virucidal effect of myricetin by plaque reduction n=3)**P<0.01 vs virus control.

Fig 5 Influence of myricetin on protein expression of virus VP1 n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs virus control.

2.5 楊梅素對EV71病毒RNA復制的影響此外，用不同濃度的楊梅素預處理100 TCID50的EV71，在EV71感染Vero細胞6 h后提取RNA，應用RT-PCR 的方法檢測VP1蛋白的mRNA 的表達水平。結果如Fig 6所示，楊梅素在12.5～50 μmol·L-1的濃度范圍內能夠明顯降低 EV71 誘導的VP1 的 mRNA 的表達，且呈劑量依賴性。說明楊梅素作用EV71之后明顯抑制病毒吸附后的復制過程，這可能與其抑制病毒吸附和進入過程有關。

3 討論

楊梅素屬于黃酮類化合物，具有多種不同的生物活性，如抗氧化、抗菌、和抗炎作用。楊梅素已被證明具有抗病毒作用，如抗HIV-1和SARS冠狀病毒活性。但目前為止，關于楊梅素抗 EV71活性的研究尚少。本研究利用Vero和RD細胞模型發現楊梅素能夠抑制EV71病毒的體外增殖，并能夠降低病毒VP1蛋白的mRNA和蛋白表達水平，提示其具有很好的抗EV71活性。

Fig 6 Influence of myricetin on mRNA expression of virus VP1 n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs virus control

我們對楊梅素的體外抗EV71作用機制進行了初步探討，發現預處理病毒和吸附時加藥能夠顯著降低EV71的病毒滴度，減少病毒感染引起的細胞死亡，提示其可能作用于病毒本身。空斑減少實驗進一步證明楊梅素能夠直接作用于病毒顆粒從而抑制EV71的感染過程。CPE免疫印跡和RT-PCR實驗表明吸附后加入楊梅素也能夠抑制EV71感染和VP1蛋白的表達，因此楊梅素可能還能夠抑制病毒進入或者后續的感染步驟。

綜上所述，楊梅素具有很好的體外抗EV71感染作用，其作用機制主要與直接作用于病毒顆粒本身有關，但是具體的分子靶點有待于進一步研究。楊梅素的體內抗EV71作用將會在乳鼠模型上進行進一步驗證。

本文研究首次揭示了楊梅素的抗EV71作用，并初步探究了楊梅素的抗EV71作用機制。相關研究表明楊梅素具有開發成潛在抗EV71病毒制劑的潛力，值得進一步深入研究。