吡唑啉酮銅配合物通過內外信號途徑誘導人肝癌細胞BEL-7404凋亡

閆海力，李金耀，許貫誠，吳燕飛，李欣奕，王 茹,李艷紅，王小靜,趙惠新，李金玉

(1. 新疆師范大學生命科學學院，干旱區植物逆境生物學實驗室，新疆 烏魯木齊 830054；新疆大學2.生命科學與技術學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室、3.應用化學研究所，先進功能材料自治區重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046)

原發性肝癌是一種全球發病率第七、死亡率第三，5年生存率僅為18%的一種常見惡性腫瘤[1-2]。目前手術配合化療仍然是肝癌的一線治療方法。諸如順鉑、卡鉑、奧沙利鉑等鉑類藥物已用于肝癌的臨床治療。但這些藥物伴有嚴重的副作用和抗藥性。因此，急需開發高效低毒的新型化療藥物。

4-酰基吡唑啉酮衍生物是一類含有氮雜環的β-二酮，含有靈活的配位原子和配位方式，可直接與過渡金屬離子形成具有生物活性的化合物，具有抗菌[3]、抗腫瘤[4-5]、抗氧化[6]等生物活性，并能克服傳統抗腫瘤藥物引起的耐藥性及毒副作用，因此4-酰基吡唑啉酮金屬配合物是具有潛力的新型抗腫瘤藥物。研究證實，4-酰基吡唑啉酮金屬配合物對卵巢癌[5]、宮頸癌[4,7]、食管癌[7-9]、黑色素瘤[10]等具有一定的增殖抑制作用，甚至有的活性優于順鉑[9]，但對肝癌作用及其機制少見報道。研究發現，某些混合配體銅配合物能強烈結合和切割DNA，表現出顯著的抗癌活性[11]。為了尋求更好的具有生物活性的新型過渡金屬配合物，本研究設計合成了一種4-酰基吡唑啉酮和呋喃甲酰肼(furoic acid hydrazide，FAH) 的新型席夫堿配體，并引入2,2’-聯吡啶(bipyridine，bpy)輔配體，通過溶液法制備了Cu配合物(P-FAH-Cu-bpy)，以期探討此新型配合物的抗肝癌活性和抗腫瘤機制，為進一步開發4-酰基吡唑啉酮金屬配合物奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人肝癌細胞BEL-7404，購于上海歐易生物醫學科技有限公司。

1.1.2藥物與主要試劑 P-FAH-Cu-bpy由新疆大學應用化學研究所制備；MTT、二甲基亞砜(DMSO)(美國 Sigma 公司)；順鉑(Cisplatin)(上海源葉生物有限公司)；RPMI 1640培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、雙抗(青霉素和鏈霉素混合液)，美國Gibco公司；細胞凋亡試劑盒，上海翊圣生物科技公司；細胞周期試劑盒，美國BD公司；Hoechst 33258染液，活性氧(reactive oxygen species，ROS)和線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，Δψm)試劑盒，β-actin、Bcl-2抗體，上海碧云天生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，ECL顯色劑，美國賽默飛公司；caspase-3/7/8/9、Cyto C、Bax抗體、山羊抗鼠 IgG 和山羊抗兔IgG，美國Cell Signaling Technology公司；PARP、VEGF抗體，武漢博士德公司；MMP-2抗體，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。1-苯基-3-甲基-4-對氯苯甲酰基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-4-(4-chlorobenzoyl)-5-pyrazolone，PM4ClBP)，FAH，bpy，甲醇，乙醇，冰醋酸，Cu(OAC)2·H2O均為分析純。

1.1.3儀器 Bruker APEXII CCD X-射線單晶衍射儀(德國Bruker公司)，Benchmark plus酶標儀(美國Bio-Rad公司),FACS Calibur流式細胞儀( 美國BD Biosciences 公司)，LAS4000超敏化學發光成像儀(美國GE公司)，Eclipse E20熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，臺式高速冷凍離心機(美國Thermo公司)

1.2 方法

1.2.1P-FAH-Cu-bpy配合物的合成

1.2.1.1 1-苯基-3-甲基-4-對氯苯甲酰基-5-吡唑啉酮縮呋喃甲酰肼配體(N-(1-phenyl-3-methyl-4-(4-chlorobenzoyl)-5-pyrazolone)-2-furancarboxylic acid hydrazide,PM4ClBP-FAH(H2L))的合成 將FAH (2.52 g 20 mmol) 溶解于40 mL熱的乙醇中，等物質量的PM4ClBP (6.26 g 20 mmol)溶解于40 mL乙醇中，待完全溶解后加入至FAH的乙醇溶液中，再加入7-8滴冰醋酸作為催化劑，回流攪拌4 h后得到黃色溶液。冷卻后可得粗產品，抽濾、乙醇重結晶后得到純凈的黃色固體產物，產率75%。將PM4ClBP-FAH (0.042 g 0.1mmol)溶于10 mL乙醇后過濾，濾液緩慢揮發，五天后得到黃色塊狀晶體。C22H17ClN4O3(F.w.: 420.85),元素分析：實測值 (理論值 %) ：C 62.73 (62.59),H 4.04 (4.25),N 13.31 (13.64) 。

1.2.1.2 [Cu(L)(bpy)]·CH3OH配合物的合成 將配體H2L (0.029 5 g 0.07 mmol)溶解于10 mL甲醇與CH2Cl2(8/2,V/V)溶液中，等物質量Cu(OAC)2·H2O (0.0140 g 0.07 mmol)的甲醇溶液逐滴加入到配體溶液中，攪拌10 min后，向混合溶液中加入等物質量2,2’-聯吡啶(0.0109 g 0.07 mmol)的甲醇溶液，室溫下攪拌反應2 h后過濾。濾液置于室溫下緩慢揮發，1周后得到綠色晶體。C33H27ClCuN6O4(F.w.: 670.60),元素分析：實測值 (理論值 %) ：C 59.05 (59.28),H 4.02 (4.15),N 12.52 (12.37) 。

1.2.1.3 X-射線單晶衍射實驗 晶體衍射數據在Bruker APEXII CCD X-射線單晶衍射儀上收集，入射線選用λ=0.71073 ?的石墨單色化的Mo-κa射線。采用Bruker Shelxtl程序，用直接法解出晶體結構(Fig 1)，用全矩陣最小二乘法對全部非氫原子進行精修。

1.2.2細胞培養和試劑配制 將BEL-7404細胞接種在含有10% FBS、青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養基,并置于37 ℃ 、5% CO2培養箱培養，取對數生長期的細胞進行實驗。

表3結果顯示：在概念表征的四個水平中，學生的平均分與滿分之間具有顯著差異，由此可說明學生的四個水平均較弱，并且內外表征水平均沒有相關性，可知學生不善于將內部表征外顯化。

P-FAH-Cu-bpy配合物使用前用DMSO溶解配成7.5 mmol·L-1母液，過濾除菌后4 ℃避光保存，使用時用RPMI 1640培養基稀釋成工作液。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期的BEL-7404細胞，胰蛋白酶消化，制成8×106·L-1的細胞懸液，每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板中，37 ℃培養24 h后，用P-FAH-Cu-bpy(0、3、4.5、6、7.5 nmol·L-1)和0.1% DMSO(相當于7.5 nmol·L-1工作液中DMSO的濃度)分別處理 BEL-7404 細胞24、48、72 h，以不加配合物為空白對照，順鉑為陽性對照。然后，1 200 r·min-1離心7 min，棄上清，加入100 μL無血清RPMI 1640培養基稀釋的MTT 溶液(0.5 g·L-1)，37 ℃孵育4 h后，移除MTT溶液，每孔加入200 μL DMSO 震蕩10 min溶解結晶紫，酶標儀490 nm處讀取各孔吸光度值，按照如下公式計算細胞的相對活性：細胞的相對活性/%=實驗組平均OD值/對照組平均OD值×100%。

1.2.4倒置顯微鏡和Hoechst 33258 染色法觀察細胞及核形態變化 按照MTT法接種和培養細胞， P-FAH-Cu-bpy(0、3、4.5、6、7.5 nmol·L-1)作用細胞24 h，采用倒置顯微鏡觀察BEL-7404細胞形態；取對數期生長的BEL-7404細胞，以每孔1×105個細胞接種于24孔細胞培養板，37 ℃培養24 h后，P-FAH-Cu-bpy(0、3、4.5、6 nmol·L-1)作用24 h，移除培養基，PBS清洗1次，預冷的4%多聚甲醛4 ℃固定10 min，PBS清洗2次，移除PBS，每孔加入500 μL Hoechst 33258染色劑,避光染色10 min，熒光倒置顯微鏡觀察拍照。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期的BEL-7404細胞以每皿4×105個細胞接種于60 mm細胞培養皿，37 ℃培養24 h后，P-FAH-Cu-bpy(0、3、4.5、6 nmol·L-1)處理24 h，胰蛋白酶消化制備細胞懸液，1 200 r·min-1離心7 min，移除上清，PBS洗兩次。然后按照Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書避光染色10 min，流式細胞儀進行檢測分析。

1.2.6流式細胞術檢測細胞周期 按照“1.2.5”方法接種細胞，37 ℃培養24 h后，P-FAH-Cu-bpy(0、3、4.5 nmol·L-1)作用12 h，胰蛋白酶消化制備細胞懸液，1 200 r·min-1離心7 min，移除上清，PBS洗兩次，70%預冷乙醇4 ℃固定3 h，使用碘化丙啶(PI)染色，流式細胞儀進行分析。

1.2.7流式細胞術檢測胞內ROS和Δψm 按照“1.2.5”方法接種細胞，37 ℃培養24 h后，P-FAH-Cu-bpy(0、3、4.5、6 nmol·L-1)作用24 h，胰蛋白酶消化制備細胞懸液，1 200 r·min-1離心7 min，移除上清，PBS洗一次，然后采用(1)DCFH-DA熒光探針37 ℃孵育30 min，PBS洗一次，流式細胞儀檢測胞內ROS；(2)JC-1熒光探針37 ℃孵育30 min，PBS洗一次，流式細胞儀檢測Δψm。

1.2.8劃痕實驗檢測細胞遷移 取對數期生長的BEL-7404細胞以每孔1×105個細胞接種于24孔細胞培養板，37 ℃培養24 h后，待細胞達到80%融合時，用10 μL槍頭在每孔中央劃線，PBS清洗一遍，分別在P-FAH-Cu-bpy(0、3、4.5、6 nmol·L-1)處理細胞0、24、48 h后，采用明場倒置顯微鏡觀察拍照，按照如下公式計算傷口愈合率/%=(1-某一時間點劃痕面積/0 h劃痕面積)×100%。

2 結果與分析

2.1 P-FAH-Cu-bpy配合物的晶體結構[Cu(L)(bpy)]·CH3OH結晶于單斜晶系，P21/c空間群，屬于單核結構，不對稱結構單元中包含了一個中心金屬Cu2+離子，一個配體陰離子L2-和一個2,2’-聯吡啶分子以及一個甲醇溶劑分子。Fig 1可知，中心金屬Cu2+離子為五配位模式，每個Cu2+離子分別與一個配體陰離子L2-的兩個氧原子和一個氮原子(O1、O2和N5)配位，另外兩個參與配位的N1和N2原子來自2,2’-聯吡啶分子，共同構成CuN3O2的配位環境，空間構型為扭曲的四方錐。基平面由O1、O2、N1和N5原子構成，其中Cu1-O1，Cu1-O2，Cu1-N1和Cu1-N5的鍵長分別為1.915(5)?，1.940(5)?，1.997(6)?和1.920(5)?，其鍵長數值均屬于正常范圍。四方錐的頂點由N2占據，其Cu1-N2的鍵長為2.143(6)?。O1-Cu1-O2和N5-Cu1-N1的鍵角分別為156.9(3)°和176.2(3)°，這些鍵角數據均不同程度的偏離理論值180°，表明Cu2+離子的配位構型為嚴重扭曲的四方錐。

Fig 1 Crystal structure of [Cu(L)(bpy)]·CH3OH

2.2 P-FAH-Cu-bpy抑制BEL-7404細胞增殖如Fig 2A 所示，隨著P-FAH-Cu-bpy作用濃度的增加，BEL-7404細胞形態逐漸從有規則到無規則，再到變圓，細胞間隙增大，細胞數量減少。MTT結果顯示，與對照組相比，P-FAH-Cu-bpy體外明顯抑制了BEL-7404細胞的增殖(P<0.01)，且呈濃度和時間效應(Fig 2B)。其作用24、48、72 h的IC50值分別為：5.85、0.43和0.03 nmol·L-1。

2.3 P-FAH-Cu-bpy誘導BEL-7404細胞凋亡

2.3.1流式細胞術檢測BEL-7404細胞凋亡數增加 如Fig 3A和Fig 3B所示，P-FAH-Cu-bpy濃度依賴性地誘導了細胞凋亡，當濃度達到6 nmol·L-1時，細胞凋亡數(58.38%)明顯高于對照組(P<0.01)，而優于順鉑組(細胞凋亡數為43.17%)。此外，與對照組相比，配合物組雖在4.5 nmol·L-1時細胞壞死的比例有明顯增加(25.3%)(P<0.05)，但隨著濃度升高，細胞壞死的比例并無濃度依賴性。這些結果表明P-FAH-Cu-bpy主要誘導了BEL-7404細胞凋亡。

2.3.2Hoechst 33258染色法觀察BEL-7404細胞核形發生變化 如Fig 3C所示，對照組和DMSO組細胞染色形態均一，而配合物組藍白熒光強，染色質固縮和核碎片化現象明顯，且呈濃度效應。進一步證明P-FAH-Cu-bpy誘導了細胞凋亡。

A: morphological changes; B: cell viability.**P<0.01vscontrol group

Fig 3 Effect of P-FAH-Cu-bpy on apoptosis of BEL-7404

The apoptosis and necrosis of BEL-7404 were analyzed by flow cytometry. A: The individual dot plots; B: the summary data; C: The nuclear morphology of BEL-7404 cells stained with Hoechst 33258. The arrows indicated the chromosomal condensation.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2.4 P-FAH-Cu-bpy阻滯了BEL-7404細胞周期如Fig 4所示，與對照組比較，配合物組顯著增加了BEL-7404細胞 G2/M期的細胞分布(P<0.01)，而降低了G0/G1期(P<0.05)和S期的細胞分布,揭示P-FAH-Cu-bpy可能將BEL-7404細胞阻滯在G2/M期。此外，與對照相比,P-FAH-Cu-bpy在4.5 nmol·L-1時明顯增加了subG1的比例(P<0.01)，表明隨著藥物濃度的增加，細胞死亡和凋亡總數目增加，與凋亡檢測結果趨勢一致。

2.5 P-FAH-Cu-bpy對BEL-7404 細胞Δψm和胞內ROS的影響

2.5.1P-FAH-Cu-bpy降低了BEL-7404細胞Δψm JC-1探針可通過檢測Δψm的變化而反映線粒體的損傷程度。隨著Δψm的減少JC-1聚集體分解成單體，相應的紅色熒光會逐漸減少而綠色熒光逐漸增多。JC-1染色流式分析顯示(Fig 5A)，P-FAH-Cu-bpy濃度依賴性地增加了綠色熒光平均熒光強度，表明P-FAH-Cu-bpy降低了BEL-7404線粒體膜電位。

2.5.2P-FAH-Cu-bpy增加了BEL-7404胞內ROS的產生 DCFH-DA熒光探針染色流式分析(Fig 5B)，與對照相比，隨著P-FAH-Cu-bpy作用濃度的增加，BEL-7404胞內ROS水平明顯升高(P<0.05和P<0.01)。同時Western blot檢測到促凋亡蛋白Bax表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，細胞色素C表達水平升高(Fig 5C)。

Fig 4 Cell cycle distribution in BEL-7404 cells upon P-FAH-Cu-bpy

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 5 Effects of P-FAH-Cu-bpy on Δψm and intracellular ROS generation in BEL-7404

A: The fluorescent intensity of JC-1 in the upper Left panel and the MFI of FITC in the lower left panel(1:Control; 2:DMSO; 3:Cisplatin; 4:P-FAH-Cu-bpy/3 nmol·L-1; 5:P-FAH-Cu-bpy/4.5 nmol·L-1; 6:P-FAH-Cu-bpy/6 nmol·L-1); B: The levels of ROS generation in the upper right panel and the MFI of DCF in the lower right panel(1:Control; 2:DMSO; 3:Cisplatin; 4:P-FAH-Cu-bpy/3 nmol·L-1; 5:P-FAH-Cu-bpy/4.5 nmol·L-1; 6:P-FAH-Cu-bpy/6 nmol·L-1); C: The expression of apoptosis-related protein Bax,Bcl-2 and Cyto C detected by Western blot(1:Control; 2:DMSO; 3:P-FAH-Cu-bpy/3 nmol·L-1; 4:P-FAH-Cu-bpy/4.5 nmol·L-1; 5:P-FAH-Cu-bpy/6 nmol·L-1).*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.6 P-FAH-Cu-bpy抑制了BEL-7404細胞的遷移和侵襲如Fig 6A和Fig 6B所示，配合物作用24 和48 h,中濃度和高濃度組傷口愈合率明顯低于對照組(P<0.01)，順鉑組變化不明顯。Western blot檢測細胞基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase，MMP-2)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達量下降(Fig 6C)。這些結果表明P-FAH-Cu-bpy抑制了BEL-7404細胞遷移和侵襲。

2.7 P-FAH-Cu-bpy對caspase家族相關凋亡蛋白的影響如Fig 7所示，P-FAH-Cu-bpy作用細胞24 h后，與對照組相比，Cleaved-caspase-3/8/9/PARP蛋白表達上調，caspase-7蛋白表達下調。

3 討論

4-酰基吡唑啉酮衍生物由于能以醇式或烯醇式結構形成不同類型的具有生物活性化合物的潛力，在藥理和生物學上常作為抗腫瘤藥物的理想配體。研究報道4-酰基吡唑啉酮銅配合物對肺癌細胞(A549)、對早幼粒細胞性白血病HL60細胞、人急性淋巴腫瘤REH細胞、小鼠神經膠質瘤C6細胞、纖維肉瘤L929細胞和黑色素瘤B16細胞具有顯著的抑制增殖作用[12-13]。本研究發現P-FAH-Cu-bpy體外顯著抑制了肝癌細胞BEL-7404的生長，且呈濃度和時間依賴性。

藥物誘導的細胞凋亡在抗腫瘤效果中發揮重要作用。本研究中，P-FAH-Cu-bpy處理BEL-7404細胞24 h后，出現了染色質凝聚、DNA斷裂等凋亡特征，流式染色分析P-FAH-Cu-bpy阻滯了細胞周期，并濃度依賴性地增加了細胞凋亡比例，且總體細胞凋亡比例高于壞死細胞比例，這些結果表明P-FAH-Cu-bpy主要通過誘導BEL-7404細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用。

Fig 6 Effect of P-FAH-Cu-bpy on migration rate of BEL-7404

A:The gating strategy of scratch area by Image J; B: The percentage of wound healing analyzed by Image J; C: The expression of protein VEGF and MMP-2 detected by Western blot.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 7 Effect of P-FAH-Cu-bpy on expression of caspase-9/3/7/8 and PARP in BEL-7404 cells detected by Western blot

細胞凋亡可受內源性線粒體途徑誘導。線粒體膜的完整性嚴格受到Bcl-2蛋白家族的調控，促凋亡蛋白Bax促進線粒體外膜的透化，而抗凋亡蛋白Bcl-2阻止線粒體外膜的透化。線粒體膜通透性的改變導致膜電位的改變，從而釋放促凋亡因子細胞色素C，進而激活caspase-9。caspase-9能夠活化和剪切下游效應因子caspase-3、7和PARP，最終誘導細胞凋亡。其中細胞色素C的釋放被認為是細胞發生凋亡的關鍵環節。本研究發現，P-FAH-Cu-bpy分別增加和降低了Bax和 Bcl-2蛋白表達的水平，而這可能導致了線粒體膜完整性的破壞。本研究中P-FAH-Cu-bpy降低了細胞膜電位，同時檢測到細胞色素C、Cleaved-caspase-9/3/PARP表達升高，caspase-7表達下調。這些結果表明P-FAH-Cu-bpy可通過內源性線粒體途徑誘導BEL-7404細胞凋亡。

ROS的產生在以降低細胞膜電位介導的細胞凋亡中發揮重要作用。本研究發現，P-FAH-Cu-bpy作用細胞24 h后，ROS水平上升，推測ROS的增多改變了細胞膜通透性，降低了膜電位，進而增加了細胞色素C的表達，引發了線粒體凋亡的信號級聯放大反應，最終誘導了細胞凋亡。

細胞凋亡也可以由外源性死亡受體途徑誘導，通過死亡受體傳遞信號，促進死亡誘導信號的形成裂解并激活caspase-8，從而引發蛋白水解，最終導致細胞凋亡。本研究中，Cleaved-caspase-8表達上調，表明P-FAH-Cu-bpy也可通過外源性死亡受體途徑誘導BEL-7404細胞凋亡。

細胞遷移是惡性腫瘤侵襲和轉染的關鍵步驟。順鉑在腫瘤治療中很容易導致藥物耐藥性,需要和其他抗癌藥物聯用才能抑制腫瘤轉移[14]。銅雖是血管內皮生成的重要因子，然而許多研究證明銅配合物也能直接影響癌細胞的遷移和侵襲[15]。本研究發現，P-FAH-Cu-bpy明顯抑制了細胞的遷移，優于順鉑組。MMP-2和VEGF表達下調，進一步證明P-FAH-Cu-bpy抑制了細胞遷移和侵襲。

綜上所述， P-FAH-Cu-bpy抑制了人肝癌細胞BEL-7404的增殖、遷移和侵襲，并能夠誘導其凋亡，其凋亡機制可能與線粒體(內源信號)和死亡受體(外源信號)途徑有關。