七葉皂苷鈉通過抑制4EBP1的磷酸化進(jìn)而減緩CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化

李 揚(yáng),周大臣,謝海深,劉付寶,熊奇如,耿小平

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科，安徽 合肥 230601；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院高新院區(qū)肝膽胰外科，安徽 合肥 230022)

肝纖維化(liver fibrosis，LF)是一種可逆的肝臟損傷修復(fù)反應(yīng)，由病毒性肝炎、酒精性損傷等多種因素引起，以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度沉積為特征[1]。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活或活化是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源，被認(rèn)為是肝纖維化的核心環(huán)節(jié)[2]。多種生長因子可激活HSCs，如血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)。PDGF是HSCs最有效的有絲分裂原，可以通過作用于磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt分子信號(hào)通路，激活靜止?fàn)顟B(tài)的HSCs進(jìn)而轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[3]。而真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(eIF4E-binding protein 1，4EBP1)是PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路下游重要的靶分子，主要調(diào)控Cap-依賴型的mRNA翻譯[4]。

七葉皂苷鈉(Sodium Aescinate，SA)是中藥娑羅子中提取的主要活性成分，具有抗炎、抗腦水腫等作用[5]。相關(guān)研究表明，SA可以改善急性肝損傷[6]，具有保護(hù)肝細(xì)胞的生物學(xué)作用。而且本課題組前期研究證實(shí)，SA可抑制肝癌細(xì)胞系中4EBP1的磷酸化，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖等。因此，我們推測SA可能通過抑制4EBP1的磷酸化進(jìn)而抑制HSCs活性以及肝纖維化的形成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株 健康Sprague-Dawley大鼠，♂，體質(zhì)量(180～200) g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK(皖)2017-001。在室溫(20～25) ℃、濕度40%～60%、12 h照明與12 h黑暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)觀察一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞株購于廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.1.2藥品與試劑 注射用七葉皂苷鈉(山東綠葉制藥有限公司);橄欖油(購自市場);四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,純度99.5%);Masson三色染色液(固綠法)(G1343,北京索萊寶科技有限公司);超敏二步法免疫組化檢測試劑盒(PV9001,北京中杉金橋公司);兔抗p-4EBP1單克隆抗體(236B4,#2855,美國CST公司);兔抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(alpha smooth muscle actin，α-SMA)(A11111,武漢愛博泰克生物科技有限公司);兔抗Ⅰ型膠原蛋白多克隆抗體(collagen Ⅰ，COL-Ⅰ)(BA0325,武漢博士德生物工程有限公司);鼠抗Ⅲ型膠原蛋白單克隆抗體(collagen Ⅲ，COL-Ⅲ) (BM1625,武漢博士德生物工程有限公司);四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT);鼠抗β-actin 單克隆抗體(美國Santa Cruz公司);ECL發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司);胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國Gibco公司);Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號(hào):556547,美國BD公司);PI/RNase Staining Buffer(批號(hào):550825,美國BD公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天公司)。

1.1.3主要儀器與設(shè)備 KHB(ST-360)酶標(biāo)儀(中國上海)，CytoFLEX 流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)，微量振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型制備及給藥方案 41只健康♂ SD大鼠隨機(jī)分為：A.正常空白對(duì)照組(n=5);B.CCl4模型組(n=18);C.七葉皂苷鈉治療組(n=18)。B和C組均腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為50%的CCl4橄欖油溶液(橄欖油：CCl41 ∶1)，每周2次，共8周(首次劑量為2 mL·kg-1，其余劑量為1 mL·kg-1)，A組給予相同劑量的橄欖油，自第3周開始，C組每天腹腔注射3.6 mg·kg-1七葉皂苷鈉溶液(溶于生理鹽水配制為1 g·L-1溶液)1次，共6周，A和B組同期給予相應(yīng)量的生理鹽水溶液。

1.2.2標(biāo)本采集 至8周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠稱重后，予以腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1進(jìn)行麻醉，手術(shù)切取標(biāo)本(肝臟組織均取自于大鼠肝右中葉)。標(biāo)本保存于RNA組織保存液(中國碧云天公司)，-80℃凍存。

1.2.3肝臟組織病理學(xué)檢查 組織標(biāo)本常規(guī)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋等處理。常規(guī)HE染色：切片依次用二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇脫蠟至水，蒸餾水漂洗，蘇木素染色10 s，蒸餾水洗10 min，伊紅染色20 s，蒸餾水洗5 min，50%、70%、95%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Masson染色：切片按上述步驟脫蠟至水，Weigert鐵蘇木素染色液染色5 min，蒸餾水洗，酸性乙醇分化15 s，蒸餾水洗，Masson藍(lán)化液返藍(lán)5 min，蒸餾水洗，麗春紅品紅染色液染色4 min，蒸餾水洗，0.2%乙酸溶液洗滌，磷鉬酸溶液分化1～2 min(顯微鏡下控制至膠原纖維呈淡紅色)， 0.2%乙酸溶液洗滌，固綠染色液染色2 min，0.2%乙酸溶液洗滌，依次置于95%乙醇、無水乙醇，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.4肝臟組織免疫組化 切片脫蠟至水，置于枸櫞酸鈉緩沖液中(含0.05%Tween-20,pH 6.0)，在高壓鍋中煮沸3 min，3%過氧化氫-甲醇混合液阻斷內(nèi)源性過氧化物活性，正常山羊血清室溫封閉1 h，使用一抗(α-SMA、COL-Ⅰ、p-4EBP1 1 ∶100稀釋，COL-Ⅲ 1 ∶50稀釋)4℃孵育過夜，次日室溫孵育二抗20 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，50%、70%、95%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.5細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6使用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，取生長狀態(tài)良好的處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞每2 d更換培養(yǎng)基1次，傳代次數(shù)不超過10代。

1.2.6MTT檢測 取對(duì)數(shù)生長期的HSC-T6，以1.5×103個(gè)/孔的密度接種至96孔板，以10、20、30、40、50、60 μmol·L-1的SA處理48 h，對(duì)照組給予相同量的DMSO，然后向每個(gè)孔中加入10 μL MTT溶液，將細(xì)胞在37 ℃下孵育4 h。加入150 μL異丙醇，在微量振蕩儀上振蕩30 min，待紫色晶體完全溶解后，使用酶標(biāo)儀在570 nm、630 nm處檢測OD值，取其差值，使用以下公式計(jì)算細(xì)胞生存率：細(xì)胞生存率/%=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。

1.2.7細(xì)胞周期 將3×108·L-1呈指數(shù)生長的HSC-T6細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿，用30 μmol·L-1的SA干預(yù)細(xì)胞48 h后，胰蛋白酶消化、離心，使細(xì)胞重懸于PBS液中，離心，棄上清，用1 mL 70%乙醇固定，加入PI染液500 μL，在4 ℃冰箱中避光染色30 min，使樣品成為合格的單細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測。

1.2.8細(xì)胞凋亡檢測 將HSC-T6細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿,貼壁后用30 μmol·L-1的SA處理48 h,胰蛋白酶消化,預(yù)冷PBS洗滌2次后,用100 μL 緩沖液(1×108·L-1)重懸后，然后加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI,避光反應(yīng)15 min,最后加入400 μL緩沖液至管中,通過流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.9Western blot 將細(xì)胞在RIPA裂解液中冰浴裂解20 min，4 ℃、13 200 r·min-1離心20 min。將上清液保存在-80 ℃。使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。將等量的蛋白質(zhì)加載到SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5% BSA室溫下封閉1 h,抗體α-SMA(1 ∶500)、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ和p-4EBP1(1 ∶1 000)在4 ℃孵育過夜。與二抗(1 ∶10 000)在室溫下孵育1 h。ECL 試劑盒顯色，使用Image J軟件分析Western blot灰度值。

1.2.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過軟件Prism 6.0 (GraphPad，San Diego，CA)實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞相關(guān)數(shù)據(jù)均獨(dú)立重復(fù)3次。定性資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析，兩組間的計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)分析，多組(≥3組)之間計(jì)量資料比較采用One-way ANOVA分析(Dunnett’s post-hoc檢驗(yàn)方法)。

2 結(jié)果

2.1 SA減緩CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟纖維化形成本研究中，CCl4模型組及SA治療組共36只大鼠，其中17只死亡，存活率53%。正常對(duì)照組肝臟表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)軟。CCl4模型組肝臟表面呈粗顆粒狀，邊緣鈍，質(zhì)韌。SA治療組肝臟組織表面呈細(xì)小顆粒狀，質(zhì)地較CCl4模型組稍軟(Fig 1)。

Fig 1 Photographs, HE staining (×100), Masson staining (×200), immunohistochemistry (×200) of liver tissues in normal control, CCl4 model and SA-treated groups

HE染色以及Masson染色結(jié)果顯示(Fig 1)，CCl4模型組及SA治療組較正常對(duì)照組均有纖維組織增生，SA治療組較CCl4模型組膠原纖維增生明顯減少，肝纖維化程度明顯減輕。

2.2 SA抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡MTT結(jié)果顯示(Fig 2)，SA處理48 h后可以明顯抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖。Fig 3細(xì)胞凋亡結(jié)果分析表明，SA(30 μmol·L-1)能明顯促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞的早期凋亡。但是同樣濃度的SA處理HSC-T6細(xì)胞后，細(xì)胞周期卻無明顯變化(Fig 4)。

Fig 2 Effect of SA on HSC-T6 cell lines for 48 h n=3)

Fig 3 Effect of SA on apoptosis of HSC-T6 cells n=3)

A:The number of early apoptosis of SA-treated HSC-T6 cells was higher than that of the control group; B:The early apoptotic rate of SA-treated HSC-T6 cells was significantly higher than that of the control group,*P<0.05vscontrol.

Fig 4 Effect of SA on cell cycle of HSC-T6 n=3)

A: The number of HSC-T6 cells in the cell cycle of the control group and SA-treated group; B: SA has no significant effect on the cell cycle of HSC-T6 cells.

2.3 SA抑制大鼠肝臟以及HSC-T6細(xì)胞COL-Ⅰ, COL-Ⅲ的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示(Fig 1)，COL-Ⅰ、COL-Ⅲ以及α-SMA在正常肝臟組織中主要分布于血管壁周圍。COL-Ⅰ、COL-Ⅲ在CCl4模型組中的表達(dá)明顯高于SA治療組，而α-SMA的表達(dá)無差異。Western blot結(jié)果表明，SA可下調(diào)HSC-T6細(xì)胞中COL-Ⅰ及COL-Ⅲ的表達(dá)，α-SMA的表達(dá)仍無差異(Fig 5)。

2.4 SA下調(diào)大鼠體內(nèi)以及HSC-T6細(xì)胞4EBP1的磷酸化水平免疫組化結(jié)果提示，SA治療組的大鼠肝臟組織中4EBP1磷酸化水平較CCl4模型組下調(diào)(Fig 1)。同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示經(jīng)過SA處理的HSC-T6細(xì)胞4EBP1磷酸化水平降低(Fig 5)。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均表明SA可下調(diào)4EBP1磷酸化水平。

3 討論

七葉皂苷鈉目前在臨床上主要應(yīng)用于慢性下肢靜脈功能不全、腦水腫、創(chuàng)傷性及外科術(shù)后軟組織腫脹等的治療[5]。肝纖維化是由于酒精中毒、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎和膽汁淤積性肝病等多種因素誘導(dǎo)的情況下，肝細(xì)胞和肝庫普弗細(xì)胞(Kupffer 細(xì)胞)分泌細(xì)胞因子、活性氧、趨化因子和生長因子等化合物并且刺激HSCs活化，從而促進(jìn)肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)的過度積累，并導(dǎo)致纖維性瘢痕形成的病理過程[7]。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，中藥在抑制肝纖維化進(jìn)展和促進(jìn)肝纖維化逆轉(zhuǎn)方面有著它獨(dú)特的優(yōu)勢，并且很多研究從機(jī)制上肯定了其作用，但七葉皂苷鈉是否能夠?qū)Ω卫w維化具有一定的治療效果尚無明確研究。

Fig 5 Expression of p-4EBP1, α-SMA,COL-Ⅰ and COL-Ⅲ in HSC-T6 cells after SA treatment n=3)

A: Western blot was used to detect the expression of p-4EBP1, α-SMA,COL-Ⅰ and COL-Ⅲ in the control group and SA-treated group of HSC-T6 cells; B:p-4EBP1, α-SMA,COL-Ⅰ and COL-Ⅲ gray value ratio,*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

細(xì)胞外基質(zhì)的過度合成，例如膠原蛋白(主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白)，是所有纖維化疾病發(fā)生的分子標(biāo)志。Ⅰ型膠原主要通過整合素α1β1、 Ⅲ型膠原主要通過盤狀結(jié)構(gòu)域受體1作用于HSCs的激活、增殖以及遷移[8]。HSCs在細(xì)胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生、沉積中發(fā)揮主要作用。α-SMA以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)增高是HSCs激活的重要標(biāo)志[9]。萬星等[10]的研究表明，鬼箭羽醇提物可以通過降低Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA的生成從而達(dá)到抑制實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的作用。本研究中大鼠肝臟組織免疫組化結(jié)果提示七葉皂苷鈉可以減少大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原的合成，而且細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)七葉皂苷鈉可以抑制HSCs的增殖并降低Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達(dá)。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示七葉皂苷鈉可明顯減緩CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化，因此可以認(rèn)為七葉皂苷鈉通過抑制HSCs的增殖降低Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達(dá)，進(jìn)而減少細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)其抗纖維化作用。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，阻斷該通路可以抑制HSCs的活化、增殖以及膠原的分泌，從而抑制肝纖維化的發(fā)展[11]。Walker等[12]證實(shí)纖維化過程中間充質(zhì)細(xì)胞中Ⅰ型膠原纖維的表達(dá)依賴于mTOR復(fù)合物1介導(dǎo)的4EBP1信號(hào)軸。Pérez de Obanos等[13]的研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸可以通過激活4EBP1的磷酸化進(jìn)而在mRNA翻譯水平誘導(dǎo)Ⅰ型膠原蛋白的產(chǎn)生并激活HSCs。Dai等[14]的研究表明，神經(jīng)肽Y通過激活mTOR/4EBP1信號(hào)通路誘導(dǎo)肝纖維化發(fā)生，并且其受體拮抗劑可以阻斷該纖維化反應(yīng)。我們課題組前期研究表明，七葉皂苷鈉可以下調(diào)肝細(xì)胞癌細(xì)胞中4EBP1的磷酸化水平并抑制肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系的增殖。因此，我們推斷七葉皂苷鈉抑制HSCs活性的機(jī)制可能與4EBP1的磷酸化有關(guān)，通過檢測七葉皂苷鈉處理后的大鼠肝臟組織以及HSCs中4EBP1的磷酸化水平，我們發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉明顯抑制了4EBP1的磷酸化水平。因此，我們認(rèn)為七葉皂苷鈉抑制HSCs增殖的生物學(xué)過程可能與4EBP1的磷酸化抑制有關(guān)。

綜上所述，七葉皂苷鈉通過抑制HSCs增殖減緩肝纖維化進(jìn)展，并且與4EBP1的磷酸化的失活有關(guān)。本研究結(jié)果提示七葉皂苷鈉可作為潛在的治療肝纖維化的藥物。但是七葉皂苷鈉的分子生物學(xué)機(jī)制應(yīng)該是多方面的，并且我們?nèi)匀辉谏钊胙芯科呷~皂苷鈉在抑制肝纖維化中的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用的可能性提供更加充分的基礎(chǔ)支持。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在安徽醫(yī)科大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心完成，在此特別感謝實(shí)驗(yàn)室老師和同學(xué)的指導(dǎo)和幫助！)