川陜金蓮花黃色素提取工藝優(yōu)化及穩(wěn)定性與抗氧化性的研究

盧佳云，陳煉紅，王琳琳，張巖

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

川陜金蓮花(TrolliusbuddaeSchipcz.)，又名金梅草、旱金蓮、駱駝七(陜西)，是毛莨科金蓮花屬的植物, 分布于四川北部、甘肅南部及陜西南部。其味辛辣，嫩梢、花蕾、新鮮種子可作為食品調(diào)味料。綠色種莢可腌制泡菜，脆嫩可口，微辣甘甜。未熟的葉有辛辣味，作香辛料使用或用于泡菜[1]；可藥用，有活血、破血的功效[2]。據(jù)《中藥大辭典》記載，金蓮花具有一定的清熱解毒功效，可以用于治療上呼吸道感染、扁桃體炎和咽炎等疾病。其味苦清泄，性寒清熱，毒性小，副作用少，因此廣泛應(yīng)用于臨床治療[3]。川陜金蓮花黃色素的主要成分為黃酮類化合物，而黃酮類化合物具有很好的溶解特性，既有水溶性的黃酮類化合物，又有脂溶性的黃酮類化合物，所以，川陜金蓮花黃色素作為著色劑可以滿足食品加工的需要[4]。抗氧化劑對于改善人體衰老、癌癥等具有一定的效果，目前國內(nèi)對川陜金蓮花的研究多見于成分分析和藥理活性研究，而對金蓮花黃色素的提取工藝和食用價(jià)值的研究少見報(bào)道[5-7]。本試驗(yàn)對川陜金蓮花黃色素的提取工藝進(jìn)行了研究，對其穩(wěn)定性和抗氧化活性進(jìn)行了評價(jià)，可以為川陜金蓮花黃色素的利用提供理論依據(jù)，還可利用其葉子的辣味，開發(fā)出具有金蓮花特色的功能性食品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

川陜金蓮花：購自甘肅省甘南藏族自治州合作市；無水乙醇、氯仿、丙酮、石油醚、氯化鈣、氯化鎂、氯化鋁、氯化鉀、抗壞血酸、山梨酸鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、DPPH、過氧化氫：均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；蔗糖：成都市糖酒有限責(zé)任公司；食鹽：四川久大制鹽有限責(zé)任公司。

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FW100 高速萬能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；UV-1000 型紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；5804R 離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 川陜金蓮花黃色素提取工藝

干燥的川陜金蓮花經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，按一定的料液比加入不同浸提劑，在一定的提取溫度、時(shí)間條件下進(jìn)行提取，經(jīng)過濾、離心后，取上清液，將離心后取得的上清液在60 ℃下蒸發(fā)3～4 h，得到川陜金蓮花黃色素的提取液，測定溶液的吸光度。

1.2.2 川陜金蓮花光譜特性的確定

將0.01 g/mL的色素溶液用紫外-可見光分光光度儀在波長350～550 nm范圍內(nèi)測定其吸光值，測得最大吸收波長為450 nm[8]。

1.2.3 川陜金蓮花黃色素提取條件的正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)觀察其對色素提取的影響，在此基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對川陜金蓮花黃色素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并利用 Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.3 色素的穩(wěn)定性

1.3.1 溫度對川陜金蓮花黃色素穩(wěn)定性的影響

采取最優(yōu)組合提取色素后，取5 mL色素提取液，用蒸餾水定容至50 mL，取稀釋好的色素置于不同溫度的恒溫水浴鍋中，水浴3 h后取出，迅速冷卻至室溫，在波長450 nm處測其吸光值。

1.3.2 食品添加劑對川陜金蓮花黃色素穩(wěn)定性的影響

采取最優(yōu)組合提取色素后，取5 mL色素提取液，用不同濃度的食品添加劑(食鹽、蔗糖、山梨酸鉀等)溶液定容至50 mL，以同濃度的食品添加劑溶液作為參比，在室溫下靜置，每隔一段時(shí)間，在波長450 nm處測定其吸光度。

1.3.3 還原劑(抗壞血酸)對川陜金蓮花黃色素穩(wěn)定性的影響

采取最優(yōu)組合提取色素后，取5 mL色素提取液，用不同濃度的抗壞血酸溶液將其定容至50 mL，用相對應(yīng)的抗壞血酸溶液作為參比，在室溫下靜置，每隔一段時(shí)間，在波長450 nm處測定其吸光度。

1.3.4 金屬離子對川陜金蓮花黃色素穩(wěn)定性的影響

采取最優(yōu)組合提取色素后，分別取5 mL色素提取液，用濃度為0.1%的不同金屬離子溶液定容至50 mL，用相對應(yīng)的金屬離子溶液作為參比，在室溫下靜置，每隔一段時(shí)間，在波長450 nm處測定其吸光度。

1.4 川陜金蓮花黃色素的抗氧化活性試驗(yàn)

運(yùn)用體外抗氧化活性研究的方法，測定川陜金蓮花黃色素對·OH和DPPH·的清除能力，并與相同濃度抗壞血酸的清除能力相對比，以此來評價(jià)川陜金蓮花黃色素的抗氧化活性[9,10]。

1.4.1 川陜金蓮花黃色素對·OH清除能力的測定[11]

將川陜金蓮花黃色素濃縮液用超純水稀釋，配制成濃度為10，15，20，25 mg/mL的色素溶液，同時(shí)配制相同濃度的抗壞血酸溶液；取9份1 mL 9×10-3mol/L FeSO4，1 mL 9×10-3mol/L水楊酸加入已標(biāo)記的試管中，搖勻，分別加入2 mL不同濃度的色素溶液及抗壞血酸溶液，空白組加入等量H2O，最后加入1 mL 8.8×10-3mol/L H2O2啟動反應(yīng)，振蕩、搖勻后避光靜置30 min；用H2O代替H2O2溶液的本底作為參比在510 nm處測定吸光度值。

式中：W為·OH自由基的清除率；A0為空白組的吸光度；Ax為試驗(yàn)組的吸光度；Ax0為參比的吸光度。

1.4.2 川陜金蓮花黃色素對DPPH·清除能力的測定[12]

用超純水稀釋色素濃縮液，配制成濃度為10，15，20，25 mg/mL的色素溶液，同時(shí)配制相同濃度的抗壞血酸溶液；取9份2 mL 0.2×10-3mol/L DPPH·溶液(無水乙醇配制)加入標(biāo)記好的試管中，再分別加入2 mL不同濃度的色素溶液和抗壞血酸溶液，空白組加入等量H2O；常溫下避光反應(yīng)30 min，然后以無水乙醇代替DPPH·溶液的本底作為參比，測定其在517 nm下的吸光度值。

式中：W為DPPH·自由基的清除率；A0為空白組的吸光度；Ax為試驗(yàn)組的吸光度；Ax0為參比的吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

為盡可能減小試驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差, 對每個(gè)試驗(yàn)做3次平行試驗(yàn), 通過Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, 采用測定數(shù)值的平均值進(jìn)行結(jié)果分析和作圖。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑的篩選

準(zhǔn)確稱取0.5 g川陜金蓮花粉末5份，分別用等量的水、95%乙醇、丙酮、氯仿、石油醚等以料液比1∶5 (m/V)浸提1 h，觀察顏色。結(jié)果表明，色素在丙酮、氯仿和石油醚中溶解性較差，在水和乙醇溶液中溶解度較好，本試驗(yàn)選擇水作為最佳浸提溶劑，省去了其他物質(zhì)對色素的影響。

2.1.2 料液比對川陜金蓮花黃色素提取的影響

圖1 不同料液比對川陜金蓮花黃色素吸光度的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on absorbance of Trollius buddae Schipcz.yellow pigment

由圖1可知，色素吸光值隨料液比的增加呈先增大后降低的趨勢，料液比在1∶40時(shí)，色素吸光值達(dá)到最大值，之后隨料液比的增大而下降。這是由于在一定范圍內(nèi)增加浸提液體積可以增大溶劑與浸提物的接觸面積，使水溶性的色素能夠較多溶出，但浸提液體積繼續(xù)增大會使色素的溶出達(dá)到飽和，吸光值趨于平穩(wěn)或稍有降低。考慮到浸提液體積過大會增加提取時(shí)間，浸提液體積過小又會使色素提取不完全而浪費(fèi)原料，所以，選擇料液比在1∶40左右最為合適。

2.1.3 提取溫度川陜金蓮花黃色素提取的影響

圖2 不同提取溫度對川陜金蓮花黃色素吸光度的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on absorbance of Trollius buddae Schipcz. yellow pigment

溫度對植物成分的提取影響很大[13]。由圖2可知，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，色素提取液的吸光度相對最高，為0.792；當(dāng)溫度為70 ℃時(shí)，色素提取液的吸光度下降3.6%。隨著溫度逐漸升高，川陜金蓮花黃色素的提取速率加快，吸光值越高；但溫度過高會使色素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，色素變性速率大于色素的浸出速率時(shí)，吸光值降低，逐漸趨于較低水平。

2.1.4 提取時(shí)間對川陜金蓮花黃色素提取的影響

圖3 不同提取時(shí)間對川陜金蓮花黃色素吸光度的影響Fig.3 Effect of extraction time on absorbance of Trollius buddae Schipcz. yellow pigment

由圖3可知，當(dāng)浸提時(shí)間為 60 min時(shí)，浸提液的吸光值達(dá)到最大值，之后隨著浸提時(shí)間的延長，浸提液的吸光值減小，有可能是因?yàn)榻釡囟容^高，長時(shí)間的浸提破壞了川陜金蓮花黃色素的結(jié)構(gòu)，使浸提液的吸光值降低。因此，適宜的提取時(shí)間為60 min。

2.2 正交試驗(yàn)

由表2可知，該色素提取最佳工藝參數(shù)為A1B3C1，與試驗(yàn)結(jié)果中吸光值最高的第6試驗(yàn)組A2B3C1不相符，因此需要驗(yàn)證試驗(yàn)A1B3C1和試驗(yàn)A2B3C1。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果：A1B3C1組的吸光值為0.479，A2B3C1組的吸光值為0.546，即A2B3C1組優(yōu)于A1B3C1組。因此可得川陜金蓮花黃色素提取最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶50(g/mL)，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間60 min。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.1 不同溫度對川陜金蓮花黃色素穩(wěn)定性的影響

表3 不同溫度環(huán)境下川陜金蓮花黃色素吸光值的變化Table 3 The variance in absorbance of Trollius buddae Schipcz. yellow pigment at different temperature conditions

由表3可知，在100 ℃以下的溫度條件下，川陜金蓮花黃色素的顏色不變，吸光值變化較小，說明溫度對川陜金蓮花黃色素的影響較小。

2.3.2 食品添加劑對川陜金蓮花黃色素穩(wěn)定性的影響

表4 食品添加劑對川陜金蓮花黃色素的影響Table 4 The effect of food additives on Trollius buddae Schipcz. yellow pigment

續(xù) 表

由表4可知，食鹽對川陜金蓮花黃色素有減色作用，隨著時(shí)間延長，變化不大，但是隨著食鹽濃度增加，減色作用有輕微改善，可以與色素混合使用；蔗糖和山梨酸鉀對川陜金蓮花黃色素有一定的增色作用，且隨著時(shí)間和濃度的增加，增色作用逐漸上升，對色素原有色澤破壞較大，可能會影響其色素本身的味道[14]。

2.3.3 還原劑(抗壞血酸)對川陜金蓮花黃色素穩(wěn)定性的影響

表5 不同濃度抗壞血酸溶液及靜置時(shí)間下川陜金蓮花黃色素吸光度的變化Table 5 The variance in absorbance of Trollius buddae Schipcz. yellow pigment in different concentration of ascorbic acids and standing time

由表5可知，在抗壞血酸溶液中，隨著濃度和時(shí)間的增加，對川陜金蓮花黃色素的影響不大。說明抗壞血酸對川陜金蓮花黃色素的干擾性較小，可以用于以抗壞血酸為抗氧化劑的食品生產(chǎn)加工中。

2.3.4 金屬離子對川陜金蓮花黃色素穩(wěn)定性的影響

表6 不同金屬離子及靜置時(shí)間下川陜金蓮花黃色素吸光度的變化Table 6 The variance in absorbance of Trollius buddae Schipcz. yellow pigment in different metal ion solutions and standing time

由表6可知，在Mg2+、Ca2+、K+溶液中，隨著靜置時(shí)間的延長，對川陜金蓮花黃色素的增色效果逐漸增大；在Al3+溶液中，增色作用遠(yuǎn)高于其他3種金屬離子溶液，溶液顏色明顯加深，因此在儲存和使用川陜金蓮花黃色素時(shí)，應(yīng)該避免與Al3+接觸。金屬離子對色素有一定的影響可能是色素分子與金屬離子形成了螯合物或金屬離子溶液本身的色澤導(dǎo)致的。川陜金蓮花黃色素要避免與金屬包裝接觸，以免影響其調(diào)味效果及色澤。

2.4 抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 川陜金蓮花黃色素對·OH的清除能力

圖4 川陜金蓮花黃色素對·OH的清除能力Fig.4 The scavenging ability of Trollius buddae Schipcz.yellow pigment on·OH

由圖4可知，川陜金蓮花黃色素對·OH具有一定的清除效果，濃度越高，對·OH的清除率越大，且清除率的上升速度越迅速。但相同濃度抗壞血酸對羥自由基的清除率遠(yuǎn)高于川陜金蓮花黃色素。結(jié)果表明，川陜金蓮花黃色素具有一定去除羥自由基的能力且濃度越高，清除率越大，但效果低于同樣濃度下的抗壞血酸。

2.4.2 川陜金蓮花黃色素對DPPH·自由基的清除能力

圖5 川陜金蓮花黃色素對DPPH·的清除能力Fig.5 The scavenging ability of Trollius buddae Schipcz. yellow pigment on DPPH·

抗氧化性物質(zhì)加入到DPPH·自由基醇溶液中，會發(fā)生顏色變化的反應(yīng)，通過吸光值的變化，進(jìn)而判斷其清除能力[15]。由圖5可知川陜金蓮花黃色素對DPPH·的清除能力，以VC作對照，在濃度低于20 mg/mL時(shí)，川陜金蓮花黃色素對DPPH·的清除作用隨著色素濃度的增加呈遞增趨勢；大于20 mg/mL后，趨勢變小，色素清除DPPH·的能力趨于穩(wěn)定；色素濃度為25 mg/mL時(shí)清除作用達(dá)到最大值71.7%，結(jié)果表明，川陜金蓮花色素具有較好的清除DPPH·的作用。川陜金蓮花黃色素在食品的應(yīng)用方面有較大的開發(fā)潛力。

3 結(jié)論

正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝結(jié)果表明，川陜金蓮花黃色素的最佳提取條件為：蒸餾水、料液比1∶50(g/mL)、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間60 min，這時(shí)川陜金蓮花黃色素的吸光值為0.546±0.0036。該色素屬水溶性色素，耐熱性強(qiáng)，除 Al3+外，其余金屬離子對色素影響不大，在還原劑下有較好的穩(wěn)定性，食鹽對其有減色作用，蔗糖和山梨酸鉀添加劑有一定的增色作用。在一定濃度范圍內(nèi), 川陜金蓮花黃色素都有較好的穩(wěn)定性，DPPH·、·OH的最大清除率分別為71.7%和35.7%，但低于VC。川陜金蓮花黃色素具有較好的穩(wěn)定性和較強(qiáng)的抗氧化性，作為添加劑可對食品提供改善色澤和延長貨架期的作用。金蓮花作為調(diào)料在大部分食品加工過程中可以保持獨(dú)特的原味。因此，川陜金蓮花黃色素在具體應(yīng)用中應(yīng)在常溫、干燥條件下進(jìn)行，但在儲藏過程中避免與金屬類物質(zhì)接觸。優(yōu)化的川陜金蓮花黃色素提取工藝合理、可行，這為川陜金蓮花色素的提取及應(yīng)用提供理論參考。