電針對腦卒中肢體痙攣大鼠皮質BDNF、TrkB 及GABAa表達的影響

謝志強 謝莉娜 郭斌 劉未艾 黃麟荇 王彭漢 岳增輝

摘要：目的? 觀察電針對腦卒中肢體痙攣大鼠皮質腦源性神經營養因子（BDNF）、酪氨酸激酶受體B（TrkB）、γ-氨基丁酸（GABA）受體（GABAa）表達的影響，探討電針治療腦卒中肢體痙攣的機制。方法? 將77只SD雄性大鼠隨機分為空白組、假手術組各9只及模型儲備組59只，運用Zea Longa線栓結合內囊注射NMDA受體制作腦卒中肢體痙攣大鼠模型。18只成模大鼠隨機分為模型組、電針組。電針組取雙側陽陵泉、曲池針刺，每次30 min，每日1次，連續5 d;假手術組和模型組同期只固定不作任何干預，空白組不作任何處理。觀察各組大鼠Zea Longa評分，改良Ashworth肌張力量表評分，皮質BDNF、TrkB、GABAa mRNA及蛋白表達。結果? 與空白組、假手術組比較，模型組和電針組大鼠治療前行為學評分明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，電針組大鼠治療后行為學評分明顯降低（P<0.05）;與空白組、假手術組比較，模型組大鼠皮質BDNF、TrkB、GABAa mRNA及蛋白表達明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，電針組大鼠皮質BDNF、TrkB、GABAa mRNA及蛋白表達明顯升高（P<0.05）。結論? 電針可改善腦卒中肢體痙攣大鼠神經功能評分及肌張力，其機制可能與調節模型大鼠皮質BDNF、TrkB、GABAa表達相關。

關鍵詞：電針;腦卒中;肢體痙攣;腦源性神經營養因子;酪氨酸激酶受體B;γ-氨基丁酸受體;大鼠

中圖分類號：R245? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）02-0023-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201905042

Effects of Electroacupuncture on Expressions of BDNF， TrkB and GABAa

in Cortex of Rats with Limb Spasm after Stroke

XIE Zhiqiang， XIE Lina， GUO Bin， LIU Weiai， HUANG Linxing， WANG Penghan， YUE Zenghui

College of Acupuncture and Massage， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China

Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture on the expressions of BDNF， TrkB and GABAa in the cortex of rats with limb spasm after stroke; To explore the mechanism of electroacupuncture in the treatment of limb spasm after stroke. Methods Totally 77 SD male rats were randomly divided into blank group （9 cases）， sham-operation group （9 cases）， and model reserve group （59 cases）. Rat model with limb spasm after stroke was prepared by using Zea Longa suture-occluded and injecting of NMDA receptor in inner capsule. Then， the successfully prepared 18 rats were randomly divided into the model group and the electroacupuncture group. In the electroacupuncture group， electroacupuncture was used to stimulate Yanglingquan （GB34） and Quchi （LI11） once a day for 30 min each time， for consecutive 5 d. The sham-operation group and the model group just fixed at the same time without any intervention， while the blank group received no treatment. Zea Longa score， the modified Ashworth Tension Scale， and the mRNA and protein expressions of BDNF， TrkB， and GABAa in the cortex were observed. Results Compared with the blank group and the sham-operation group， the behavioral score of model group and electroacupuncture group increased significantly （P<0.01）. After treatment， compared with the?model group， the behavioral score of the electroacupuncture group decreased significantly （P<0.05）. Compared with the blank group and the sham-operation group， the mRNA and protein expressions of BDNF， TrkB， and GABAa in the cortex of the model group decreased significantly （P<0.05）， while the mRNA and protein expressions of BDNF， TrkB， GABAa in the cortex of the electroacupuncture group increased significantly compared with the model group （P<0.05）. Conclusion Electroacupuncture can improve neurological function score and muscle tone in rats with limb spasm after stroke， which may be through the regulation of cortical BDNF， TrkB， and GABAa.

Keywords： electroacupuncture; stroke; limb spasm; BDNF; TrkB; GABAa; rats

腦卒中后80%～90%患者出現不同程度的肢體痙攣，嚴重影響患者的生存質量。肢體痙攣發生的物質基礎是神經遞質的失衡與紊亂[1]。興奮性遞質增加或抑制性遞質減少均會引起和加重肢體痙攣。γ-氨基丁酸（GABA）作為抑制性遞質的代表性物質，與其受體結合，產生突觸前抑制作用，從而緩解肢體痙攣。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）與酪氨酸激酶受體B（tyrosibe kinase，TrkB）結合后，能促進GABA及其受體GABAa的表達。課題組前期研究顯示，電針陽陵泉、曲池能改善腦卒中肢體痙攣大鼠肌張力，其機制與上調腦卒中肢體痙攣大鼠皮質GABA及其受體GABAb的表達有關[2]。本研究觀察電針對腦卒中肢體痙攣大鼠皮質BDNF、TrkB、GABAa表達的影響，探討電針治療腦卒中肢體痙攣的相關機制。

1? 材料與方法

1.1? 動物及分組

77只SD雄性大鼠，體質量200～240 g，購于湖南斯萊克景達動物實驗有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002。飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%。隨機分為空白組（9只）、假手術組（9只）、模型儲備組（59只，造模成功后分為模型組和電針組，每組9只）。

1.2? 主要試劑與儀器

水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司），NMDA受體（武漢華聯科試劑公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型，Bioswamp，PAB180007），SYBR Green PCR試劑盒（KAPA Biosystems，KM4101），BDNF抗體（Abcam，ab108319），TrkB抗體（Abcam，ab18987），GABAa抗體（Bioss，bs-1232R）。大鼠腦立體定位儀（日本成茂公司，SN-2），SDZ-V電針儀（蘇州醫療用品廠有限公司），0.30 mm×13 mm一次性針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司），酶標儀（芬蘭雷勃公司，MK3），熒光定量PCR儀（Bio-Rad，CFX-Connect 96），超微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司，Nano-300），栓線（北京西濃科技有限公司，2838-50A4）。

1.3? 造模

采用Zea Longa線栓法結合內囊注射NMDA受體制作腦卒中肢體痙攣模型[3]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉。將麻醉后大鼠固定在手術臺，備皮消毒，沿頸部正中偏右切口，分離右側頸總動脈和迷走神經后，分別在頸總動脈遠心端、頸內動脈近心端、頸外動脈近心端備線，然后分別結扎頸外動脈近心端、頸總動脈遠心端，動脈夾夾閉頸內動脈。在離頸總動脈分叉膨大處5 mm切口，將栓線經切口插入頸內動脈，松開動脈夾，栓線深度18～20 mm時稍感阻力停止插線。插線完畢后，將頸內動脈近心端和栓線一起結扎，逐層縫合切口，縫合處撒適量青霉素。大鼠清醒后通過神經功能評分判斷造模是否成功。成模大鼠第2日行內囊注射NMDA受體。參照內囊電毀損法[4]。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠頭頂部備皮，把5 μL微量注射器（內含NMDA受體）固定于大鼠腦立體定位儀。同時將大鼠俯臥固定于大鼠腦立體定位儀，使用定位輔助裝置。沿顱頂矢狀縫作縱行切口，長約2 cm，分離筋膜暴露前囟，手術鉗向兩側拉開，暴露右側頂骨和額骨交界骨縫。參照《大鼠立體定位圖譜》[5]確定內囊位置，選擇前囟后1.4 mm、矢狀縫右側2.4 mm，用小型電鉆在顱板上鉆一直徑約2 mm小孔，將微量注射器垂直插入7 mm，緩慢注射5 μL NMDA受體，注射時間維持5 min。注射完畢后拔出微量注射器，用明膠海棉壓迫止血，碘伏消毒，傷口局部撒青霉素，最后縫合。上述造模術后均按0.1 mg/kg劑量注射呋塞米，防止腦水腫。術后予葡萄糖水及飼料喂養，單籠飼養，保持呼吸道通暢。

假手術組線栓造模時僅分離頸總動脈、迷走神經、頸內外動脈，不進行插線及結扎;內囊注射NMDA受體造模時，內囊注射5 μL生理鹽水，余步驟同模型組。

1.4? 干預

電針組：造模成功后第1日，大鼠固定于鼠板，針刺雙側陽陵泉、曲池，穴位定位參照《實驗針灸學實驗指導》[6]，并結合解剖學方法進行大鼠穴位定位。陽陵泉：距后三里（在膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm處）上外側5 mm。曲池：橈骨近端的關節外側前方凹陷。連接SDZ-V電針治療儀，波型為密波，頻率100 Hz，強度以大鼠肢體輕微抖動為度。每次30 min，每日1次，連續5 d?？瞻捉M不作任何處理，假手術組及模型組除與電針組同期只固定不進行任何干預。

1.5? 行為學檢測

分別在治療前及治療后參照Zea Longa標準進行神經功能評分[7]，1～3分提示模型成功。0分：無神經損傷癥狀;1分：不能完全伸展手術對側前爪或后爪;2分：行走時向手術對側轉圈;3分：行走時向手術對側傾倒;4分：不能自發行走，意識喪失。分別在治療前及治療后運用改良Ashworth肌張力量表進行肌張力評定[8]，1～4級提示模型成功。0級：無肌張力升高，大鼠活動自如;1級：輕度增加，抓握中被動屈伸至最后有小的阻力;1+級：輕度增加，抓握至一半運動半徑以上有輕度阻力增加;2級：肌張力在大部分運動半徑中都有較大增加，但肢體被動運動容易;3級：肌張力明顯增高，被動活動困難;4級：受累部分肢體強直性屈曲或伸直。

1.6? 標本采集

治療第5日進行Zea Longa評分及改良Ashworth量表評分后，大鼠斷頭處死，剪開顱板，取腦組織，冰盤上取出患側皮質，剝離后立即放入液氮速凍，-80 ℃保存，待測BDNF、TrkB、GABAa mRNA及蛋白表達。

1.7? 熒光實時定量PCR檢測皮質腦源性神經營養因子、受體酪氨酸蛋白激酶和γ-氨基丁酸受體mRNA表達取樣本勻漿20 s，迅速置于冰上，溫育5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入氯仿，再離心10 min，取上清液，加異丙醇，離心10 min，棄上清液，沉淀，75%乙醇漂洗2次，7500 r/min離心5 min，加入DEPC水溶解RNA，得RNA溶液，之后進行總RNA中DNA、DNase1的消除，反轉錄完成后，將其產物進行PCR擴增。以β-actin作為內參，計算2-ΔΔCt值。引物序列見表1。

1.8? Western blot檢測皮質腦源性神經營養因子、酪氨酸激酶受體B和γ-氨基丁酸受體蛋白表達

組織剪碎，按比例加裂解液（20 mg/150～250 μL），將勻漿后樣品離心，取上清液，根據BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度，蛋白質定量貯存于-80 ℃冰箱備用。PAGE膠制備完成后，樣品電泳，轉膜，轉膜完成后封閉，孵育一抗、二抗。最后待膜正面與ECL發光液充分接觸后，置于全自動化學發光分析儀中檢測，通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。

1.9? 統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行分析。符合正態分布的計量資料以—x±s表示，不符合正態分布的則以中位數和四分位間距[M（QR）]表示，多組計量資料比較，符合正態分布采用方差分析，不符合正態分布采用Kruskal-Wallis H檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? 一般狀況

模型儲備組59只大鼠線栓造模死亡11只，死亡原因為麻醉失誤、失血過多等;剩余48只清醒后進行Zea Longa神經功能評分，剔除0、4分大鼠6只，故通過評定符合模型成功標準共42只。成模大鼠進行內囊注射NMDA受體制作痙攣模型，手術過程中死亡21只，死亡原因為麻醉不當、固定不當、傷口感染、失血過多等;剩余21只大鼠清醒后進行改良Ashworth肌張力評定，剔除0級大鼠3只，共納入18只大鼠。

2.2? 電針對腦卒中肢體痙攣大鼠Zea Longa評分的影響

與空白組比較，假手術組治療前大鼠Zea Longa評分無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05），模型組、電針組大鼠Zea Longa評分明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01），提示造模成功。模型組與電針組大鼠治療前Zea Longa評分差異無統計學意義（P>0.05），具有齊同可比性;與模型組比較，電針組治療后評分明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表2。

2.3? 電針對腦卒中肢體痙攣大鼠改良Ashworth肌張力量表評分的影響

治療前與空白組比較，假手術組大鼠Ashworth評分無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05），模型組、電針組大鼠Ashworth評分均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01），提示造模成功。模型組與電針組大鼠治療前Ashworth評分比較差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，電針組治療后大鼠Ashworth評分明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表3。

2.4? 電針對腦卒中肢體痙攣大鼠皮質腦源性神經營養因子、酪氨酸激酶受體B和γ-氨基丁酸受體mRNA表達的影響

與空白組比較，假手術組大鼠皮質BDNF、TrkB、GABAa mRNA表達無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05），模型組大鼠皮質BDNF、TrkB、GABAa mRNA表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，電針組大鼠皮質BDNF、TrkB、GABAa mRNA表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表4。

2.5? 電針對腦卒中肢體痙攣大鼠皮質腦源性神經營養因子、酪氨酸激酶受體B和γ-氨基丁酸受體蛋白表達的影響

與空白組比較，假手術組大鼠皮質BDNF、TrkB、GABAa蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05），模型組大鼠皮質BDNF、TrkB、GABAa蛋白表達均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，電針組大鼠皮質BDNF、TrkB、GABAa蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表5。

3? 討論

腦卒中后高級中樞受損導致低級中樞處于失控狀態，低級中樞α運動神經出現異常興奮，從而出現肢體痙攣。GABA作為抑制性神經遞質的代表，參與正常肌張力維持的過程，其與相應受體GABAa結合后，發揮其生物學效應，抑制低級中樞α運動神經元異常興奮。BDNF作為神經營養因子家族成員之一，對大腦生理功能及突觸相關功能產生重要影響[9]。腦卒中發生后，BDNF對神經起到保護作用，同時促進神經功能恢復[10]，并參與神經遞質的調節。TrkB是BDNF的受體，兩者結合具有高度特異性。研究表明，在磷酸肌醇3-激酶和蛋白激酶C的作用下，BDNF與TrkB結合后能增加GABA的表達，促進GABAa的表達。另有研究顯示，衰老過程中BDNF分泌減少導致GABA表達下調，而給予外源性BDNF可上調GABAa的表達[11-12]。

腦卒中肢體痙攣屬中醫學“痙證”范疇，其發病部位在筋?！毒霸廊珪酚涊d：“氣中無血，則病為抽掣拘攣?！睔庋脴s，則筋脈濡養有道;氣血津液虧虛不足，筋脈得不到滋養，則會引起筋脈攣縮。陽陵泉為筋會，主治筋病，《針灸聚英》有“主膝伸不得屈……偏風半身不遂……足筋攣”，具有舒筋、壯筋的作用。曲池為手陽明經合穴，陽明經多氣多血?！秲冉洝分小爸勿舄毴￡柮鳌睘榕R床治療中風的選穴依據，另《醫宗金鑒》記載曲池“主治中風，手攣筋急”?；谏鲜隼碚?，陽陵泉、曲池在腦卒中治療肢體痙攣中廣泛應用，并且兩者能有效緩解腦卒中肢體痙攣[13-14]。

本實驗結果顯示，造模后大鼠行為學評分降低，經電針治療后行為學評分增加，提示電針能有效改善腦卒中肢體痙攣大鼠神經功能及肌張力。另外，造模后大鼠皮質BDNF、TrkB、GABAa表達下降，與已報道的文獻一致[15]。也有研究顯示，腦卒中模型大鼠BDNF、TrkB表達升高[16-17]。分析本實驗結果出現的原因可能是腦卒中發生后，神經元及星形膠質細胞受損，導致BDNF、TrkB分泌不足。經電針治療后，大鼠皮質BDNF、TrkB、GABAa表達均升高。提示電針能上調腦卒中肢體痙攣大鼠皮質BDNF、TrkB、GABAa的表達。

綜上，結合行為學及分子生物學結果，證實電針能有效改善腦卒中肢體痙攣，其具體機制可能是電針促進BDNF與TrkB的表達，兩者結合后進一步促進GABAa的表達，GABAa表達的增加，增強其與GABA結合后產生的突觸抑制作用，進而改善腦卒中后肢體痙攣狀態。

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（收稿日期：2019-05-05）

（修回日期：2019-06-25;編輯：華強）

基金項目：國家自然科學基金（81673886）;湖南省自然科學基金（2018JJ2294）;湖南省中醫藥科研計劃項目（201828）;湖南省研究生科研創新項目（CX2018B488）

通訊作者：岳增輝，E-mail：624755064@qq.com