龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細胞生長作用研究

馬卉 張潤田 1 李 航 黃敏 陳廣山 劉洋 曲天歌 包海蘭 周琳 趙艷 段行武 李玲玲

摘要 目的：研究不同濃度龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡、遷移能力的影響以及對Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白表達水平的影響。方法：1）不同濃度龍血素A作用于瘢痕疙瘩成纖維細胞，用CellTiter-Blue活力檢測試驗檢測龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響。2）流式細胞術檢測龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響。3）劃痕實驗檢測龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移的影響。4）Western-Blot測定龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細胞Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白水平的影響。結果：龍血素A可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移并誘導其凋亡，同時減少COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表達，并促進Bax、Caspase-3蛋白表達，并且均呈現劑量依賴性。結論：龍血素A可以調控瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖與凋亡的平衡、減少細胞外基質沉積，從而可能對KD發揮一定的治療作用。

關鍵詞 龍血素A;瘢痕疙瘩;成纖維細胞

Study on the Effects of Loureirin A on Keloid Fibroblast Growth Function

MA Hui1，ZHANG Runtian1，LI Hang2，HUANG Min1，CHEN Guangshan1，LIU Yang3，QU Tiange4，BAO Hailan5，ZHOU Lin1，ZHAO Yan1，DUAN Xingwu1，LI Lingling1

（1 Department of Dermatology，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，100700，China; 2 Department of Dermatology，Peking University First Hospital，Beijing，100034，China; 3 Beijing? Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100038，China; 4 Dongfang Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 5 Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，People′s Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region，Hohhot 010017，China）

Abstract Objective：To study the effects of different concentrations of Loureirin A on the proliferation，apoptosis and migration of keloid fibroblasts and the protein expression levels of Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3. Methods：1） Different concentrations of L-Auxin A act on keloid fibroblasts. CellTiter-Blue vitality test was used to test the effects of L-Auxin A on keloid fibroblast proliferation. 2） Flow cytometry was used to detect the effects of L-Auxin A on keloid fibroblasts apoptosis. 3） Scratch test was used to detect the effects of borneol A on keloid fibroblast migration. 4） Proteins expression levels of Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3 were detected by Western-Blot. Results：Loureirin A can inhibit the proliferation and migration of keloid fibroblasts，and induce their apoptosis，reduce the protein expression of Col-I、Col-III、α-SMA and promote the protein expression of Bax and caspase-3，and there is a dosage dependent relationship. Conclusion：Loureirin A can regulate the balance of keloid fibroblast proliferation and apoptosis，reduce the deposition of extracellular matrix，so it may play a certain therapeutic effects on keloid.

Keywords Loureirin A; Keloid; Fibroblast

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.06.003

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較若滿足正態性及方差齊時，采用單因素方差分析;不滿足時采用非參數檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響? 不同濃度龍血素A作用于瘢痕成纖維細胞后，與對照組比較，抑制率隨濃度升高而升高，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），且各個濃度在48 h的抑制率均最高。考慮龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細胞的抑制作用具有濃度依賴性，且48 h為藥物的最佳作用時間。見表2。

2.2 龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響? 與對照組比較，龍血素A作用于瘢痕疙瘩成纖維細胞48 h后，隨著給藥劑量的增加，活細胞數量明顯降低，凋亡細胞數量明顯增多，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。表明龍血素A能明顯誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞發生凋亡，且具有一定的濃度依賴性。見表2，圖1。

2.3 劃痕實驗檢測龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移的影響 不同濃度龍血素A作用于瘢痕成纖維細胞48 h后，劃痕寬度明顯大于對照組，且給藥濃度越大劃痕越寬;與對照組比較，50 μg/mL、30 μg/mL、10 μg/mL濃度刺激時劃痕收縮寬度的差異均有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。說明龍血素A以濃度依賴性抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的遷移。見表3，圖2。

2.4 龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細胞COL-I、COL-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白表達的影響 與對照組比較，給藥48 h后，龍血素A可下調瘢痕疙瘩成纖維細胞COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表達，并上調Bax、Caspase-3蛋白表達，且隨濃度的增加對三者的調控作用增強，50 μg/mL、30 μg/mL濃度刺激時，上述目標蛋白表達的差異有統計學意義（P<0.05）。說明龍血素A以濃度依賴性抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表達，同時促進Bax、Caspase-3蛋白表達。見表4，圖3。

3 討論

瘢痕疙瘩作為一種難治性皮膚病，常伴有瘙癢疼痛等癥狀，其損容性傷害給患者生命質量和心理健康也造成極大負面影響。發病機制方面，Fb是參與KD形成的關鍵效應細胞，它可以分泌ECM的主要成分Ⅰ、Ⅲ型膠原以及α-平滑肌肌動蛋白（α-Smooth Muscle Actin，α-SMA），從而形成KD的主要物質基礎。當Fb過度增殖或凋亡抑制時，大量膠原蛋白沉積且膠原蛋白之間進行病理性交聯，使ECM發生沉積和重構，從而形成KD[1]。因此，調控Fb增殖與凋亡的平衡對于抑制KD的形成至關重要。在線粒體通路的細胞凋亡中，Bax占優勢時細胞則發生凋亡[7]，Caspase-3蛋白是細胞另一重要的促凋亡分子，也是細胞凋亡的重要標志[8]，既往如何抑制Fb增殖及膠原形成，通過上調Bax、Caspase-3等促凋亡因子表達以誘導其凋亡是研究的核心熱點[9]。

目前其臨床治療主要包括手術療法，放射、激光等物理療法以及糖皮質激素等藥物治療[10]，但都具有一定的不良反應且易復發、難以根治，因此尋求新型、高效、低毒的抗KD新藥物迫在眉睫。中醫認為KD的關鍵病機為血行瘀滯，龍血竭外用具有散瘀止痛的功效，既往研究表明，其主要活性成分龍血素A在一定程度上可延緩肝、肺纖維化[3-4]，但與瘢痕疙瘩的相關性研究尚未展開，因此本研究旨在初步探討龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細胞生長的相關作用。

在本研究中，CellTiter-Blue活力檢測試驗顯示一定濃度龍血素A處理瘢痕疙瘩成纖維細胞后能夠顯著抑制細胞增殖，并且在呈劑量依賴關系，各個濃度均在48 h時抑制率最高;劃痕實驗表明，龍血素A以濃度依賴性抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的遷移;流式細胞儀檢測結果顯示龍血素A能明顯誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞發生凋亡，且具有一定的濃度依賴性。另本實驗采用Western-Blot實驗測定龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細胞COL-I、COL-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白水平的影響，結果顯示龍血素A以濃度依賴性抑制COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表達，同時促進Bax、Caspase-3蛋白表達，說明龍血素A可有效減少ECM的沉積，同時對Fb有促凋亡作用。

綜上所述，龍血素A可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移并誘導其凋亡，同時減少COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表達，并促進Bax、Caspase-3蛋白表達，說明龍血素A具有調控瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖與凋亡的平衡、減少細胞外基質沉積的作用，從而可能對KD發揮一定的治療作用。目前KD的發病機制尚不完全明確，但TGF-β1/Smad通路持續激活所具有的促瘢痕效應已得到廣泛公認[11]，因此龍血素A是否通過拮抗此通路的關鍵信號分子的表達從而發揮抗瘢痕效應需要下一步深入研究。

參考文獻

[1]Williams FN，Herndon DN，Branski LK.Where we stand with human hypertrophic and keloid scar models[J].Exp Dermatol，2014，23（11）：811-812.

[2]Andrews JP，Marttala J，Macarak E，et al.Keloids：The paradigm of skin fibrosis-pathomechanisms and treatment[J].Matrix Biol，2016，51（4）：37-46.

[3]聶莉，程德云，朱剛艷，等.龍血竭對肺纖維化大鼠肺組織轉化生長因子β1mRNA及Ⅰ型膠原蛋白表達的影響[J].河北中醫，2010，32（7）：1071-1074，封3.

[4]李玉蓮，范紅，宋正己，等.龍血素B對肝星狀細胞增殖及細胞外基質分泌的影響[J].山東醫藥，2012，52（13）：7-9.

[5]Mari W，Alsabri SG，Tabal N，et al.Novel Insights on Understanding of Keloid Scar：Article Review[J].J Am Coll Clin Wound Spec，2015，7（1-3）：1-7.

[6]Lian N，Li T.Growth factor pathways in hypertrophic scars：Molecular pathogenesis and therapeutic implications[J].Biomed Pharmacother，2016，84（12）：42-50.

[7]Pettersson F，Dalgleish AG，Bissonnette RP，et al.Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax[J].Br J Cancer，2002，87（5）：555-561.

[8]Liu BH，Chen L，Li SR，et al.Smac/DIABLO regulates the apoptosis of hypertrophic scar fibroblasts[J].Int J Mol Med，2013，32（3）：615-622.

[9]Pettersson F，Dalgleish AG，Bissonnette RP，et al.Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax[J].Br J Cancer，2002，87（5）：555-561.

[10]Berman B，Maderal A，Raphael B.Keloids and Hypertrophic Scars：Pathophysiology，Classification，and Treatment[J].Dermatol Surg，2017，43（1）：S3-S18.

[11]Wu C，Jiang J，Boye A，et al.Compound Astragalus and Salvia miltiorrhiza extract suppresses rabbits′ hypertrophic scar by modulating the TGF-β/Smad signal[J].Dermatology，2014，229（4）：363-368.

（2019-10-16收稿 責任編輯：王明）

基金項目：中央高校基本科研業務費專項資金資助項目（2019-JYB-JS-050）作者簡介：馬卉（1989.04—），女，博士研究生在讀，研究方向：中醫皮膚病方向，E-mail：446774193@sina.com通信作者：段行武（1965.07—），男，博士，主任醫師，研究方向：中醫皮膚病方向，E-mail：xwuduan@sina.com;李玲玲（1980.10—），女，博士，副主任醫師，研究方向：中醫皮膚病方向，E-mail：abcling@sina.com