黃芩藥材及飲片的HPLC指紋圖譜研究

安 琪，毛夢倩，孫 紅，劉亮亮，陳素娥

(山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，山西 晉中 030619)

1 引言

黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)為唇形科黃芩屬多年生草本植物，《中國藥典》2015版采用黃芩的干燥根作為其藥用部位，性苦味寒，具有清熱、燥濕、瀉火等功效[1]。黃芩在山西、陜西、東北三省等地多有分布，河北、山東為道地產(chǎn)區(qū)[2]。黃芩主要化學(xué)成分包括黃酮類、木脂素類、糖類及揮發(fā)油等，在抗炎、抗腫瘤、抗氧化等方面有很好的藥理活性[3]。

中國藥典2015版采用黃芩藥材經(jīng)過短時蒸制或沸水煮，再切片、干燥制得黃芩飲片。因此，黃芩藥材的質(zhì)量和飲片加工過程極大地影響著黃芩片的臨床療效和質(zhì)量穩(wěn)定性。本實驗選取10批黃芩藥材和飲片進行指紋圖譜相似度研究，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

2 儀器與材料

安捷倫高效液相色譜色譜儀1 100系列，黃芩苷(批號為110715-201821，純度為97.9%)、漢黃芩苷(批號為112002-201702，純度97.9%)、黃芩素(批號為111595-201808，純度為97.9%)、漢黃芩素(批號為111514-201706，純度為97.9%)，野黃芩苷對照品(批號：110842-201709；含量：91.7%)，以上對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供，色譜級和分析級甲醇均采購于天津市康科德科技有限公司。

黃芩藥材和飲片均由某企業(yè)提供，經(jīng)山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院楊翠玲副教授鑒定為唇形科黃芩屬植物黃芩的干燥根。黃芩藥材和飲片批次相同，具體批次如下表：

表1 樣品批次

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

通過對流動相不同類型、流速、色譜柱條件等條件進行優(yōu)化，采用如下色譜條件：色譜柱：Agilent zorbax XDBC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫設(shè)定為30℃；進樣體積10 μL；有機相為甲醇(A)，水相為0.1%磷酸水(B)；流速1 mL/min；檢測波長為270 nm。流動相梯度洗脫程序見下表。

表2 流動相梯度洗脫程序

3.2 對照品溶液的制備

取漢黃芩苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷、漢黃芩素對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度分別為160 μg/mL、480 μg/mL、120 μg/mL、8 μg/mL、48 μg/mL的對照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備

取黃芩、黃芩飲片粗粉約0.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加40 mL 70%甲醇，稱重，超聲提取半個小時，放置室溫冷卻，再稱重補足重量，震蕩混勻，吸取上清液，過濾得到供試品溶液。

3.4 精密度試驗

取供試品溶液一份，按照“3.1”項下重復(fù)進樣6次，對連續(xù)6次結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理。測得各共有峰的相對保留時間RSD(%)在0.01%～0.20%之間，相對峰面積RSD(%)在0.12%～3.88%之間，符合要求。

3.5 重復(fù)性試驗

取樣品粉末6份，每份約0.3 g，精密稱定，分別按照“3.3”項下方法制備供試品溶液，按照“3.1”項下進樣分析，進行數(shù)據(jù)處理。各共有峰的相對保留時間RSD(%)在0.06%～1.29%之間，相對峰面積RSD(%)在0.96%～4.95%之間，符合要求。

3.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，考察在不同時間點(0、2、4、8、12、24 h)樣品的穩(wěn)定性。測得各共有峰的相對保留時間RSD(%)在0.19%～0.45%之間，相對峰面積RSD(%)在0.08%～5.00%之間，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 樣品測定

取10批黃芩藥材樣品，按照“3.3”項下制備供試品溶液，按照“3.1”項下依次進樣分析，得到17個共有峰，通過紫外吸收光譜比對和對照品加入法進行了色譜峰的歸屬，其中4號峰為野黃芩苷，7號峰為黃芩苷，13號峰為漢黃芩苷，16號峰為黃芩素，17號峰為漢黃芩素，共指認(rèn)了5個共有峰，混合對照品和典型黃芩藥材色譜圖分別見圖1和圖2。

4-野黃芩苷;7-黃芩苷;13-漢黃芩苷;16-黃芩素;17-漢黃芩素

圖2 典型黃芩藥材色譜圖

3.8 指紋圖譜的建立

3.8.1 參比峰的選擇 樣品圖譜顯示中漢黃芩苷與相鄰色譜峰分離度良好，峰位適中，峰面積穩(wěn)定，所以確定漢黃芩苷為參比峰。

3.8.2 指紋圖譜共有模式的建立 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012A)對10批黃芩藥材及飲片進行指紋圖譜分析，以S1號藥材圖譜作為參照譜，以平均數(shù)法生成對照指紋圖譜的共有模式。選取“時間窗寬度”為0.5 min，采用中位數(shù)法計算，匹配后的10批藥材和10批飲片色譜圖見圖3和4。

圖3 10批黃芩藥材HPLC指紋圖譜

圖4 10批黃芩飲片HPLC指紋圖譜

3.9 指紋圖譜相似度分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012A)分別對10批藥材和10批飲片指紋圖譜進行相似度評價，結(jié)果見表3與表4。從表3看出10批藥材指紋圖譜與對照圖譜的相似度不低于0.991，均值在0.999，說明不同批次藥材之間相似度較高。10批飲片相似度評價結(jié)果均值為0.993，相似度較高，除S1(相似度為0.966)外，其余各批次相似度均不低于0.991。說明炮制過程批間差異較小。

表3 10批黃芩藥材指紋圖譜相似度評價結(jié)果

表4 10批黃芩飲片指紋圖譜相似度評價結(jié)果

4 討論

本實驗進行了UV全波長掃描，結(jié)果顯示在270 nm波長下，特征峰響應(yīng)較高，噪音低，黃酮類成分色譜峰信息全面。實驗中考察了流動相pH和柱溫，發(fā)現(xiàn)當(dāng)磷酸濃度為0.1%時，各特征峰峰形較好，因此選擇磷酸的濃度為0.1%。當(dāng)柱溫為30℃時，各個色譜峰有較好的分離度。

本實驗對提取溶劑進行考察，比較了不同濃度的甲醇溶液的提取效率，結(jié)果顯示當(dāng)提取溶劑為70%甲醇時，提取效率最高。實驗中考察了超聲與回流兩種提取方法的提取效率，結(jié)果表明超聲提取效率要優(yōu)于回流提取，且操作簡便，故實驗中采用超聲提取方法。

黃芩中黃酮類化合物具有很強的藥理活性，在抗炎、抗HIV、保護神經(jīng)細(xì)胞等方面有很好的作用[4]。黃光強等[5]基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物概念，提出將黃芩中的黃酮及其苷類成分作為黃芩潛在質(zhì)量標(biāo)志物的觀點，本實驗通過對黃芩藥材及飲片的指紋圖譜的研究，指認(rèn)了其中5個黃酮類成分，為后續(xù)黃芩的質(zhì)量標(biāo)志物研究提供參考。

5 結(jié)論

本實驗研究所得的HPLC指紋圖譜能夠反映黃芩藥材與飲片的固有特性，結(jié)合相似度分析，可以為黃芩藥材與飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。