Xpert MTB/RIF聯合SAT技術快速檢測痰標本中利福平耐藥結核菌 ?

馬娟 陳俊林 黃飛 徐費凡 瞿梅 顧德林

【摘要】 目的：探討Xpert MTB/RIF聯合SAT技術（RNA恒溫擴增實時檢測法，MTB-RNA）快速檢測痰標本中耐藥結核分枝桿菌（MTB）價值。方法：對2015年2月-2017年10月在南通市第六醫人民院就診172例復治肺結核患者涂陽痰標本分別進行Xpert MTB/RIF檢測、SAT檢測、BACTEC MGIT960培養及利福平（RFP）藥敏試驗。對MTB-RNA檢測陽性同時Xpert MTB/RIF報告RFP耐藥的痰標本予RFP藥物滅菌72 h后再進行SAT檢查，將Xpert MTB/RIF聯合SAT檢測的結果與BACTEC MGIT960藥敏結果進行對照分析。結果：Xpert MTB/RIF檢出耐RFP痰標本56例，BACTEC MGIT960鑒定為MTB且耐RFP痰標本44例。SAT檢測報告MTB-RNA陽性同時Xpert MTB/RIF檢出耐RFP標本50例，其中經過RFP作用72 h后再進行SAT檢測報告MTB-RNA陽性標本僅46例，稍高于BACTEC MGIT960藥敏結果，但差異無統計學意義（字2=0.25，P>0.05）。結論：利用Xpert MTB/RIF聯合SAT技術能快速檢測痰標本中耐藥MTB，對及時精準制定抗結核治療方案具有重要參考價值。

【關鍵詞】 結核分枝桿菌 利福平 藥敏試驗 XpertMTB/RIF RNA恒溫擴增實時檢測法

[Abstract] Objective： To assess the value of rapid detecting heterogeneity drug resistance mycobacterium tuberculosis （MTB） in sputum specimens by Xpert MTB/RIF joint SAT tests （RNA real-time thermostatic expansion SAT tests，MTB-RNA）. Method： A total of 172 cases sputum smear-positive specimen of recurrent pulmonary tuberculosis patients from February 2015 to October 2017 in Nantong Sixth Peoples Hospital were detected by Xpert MTB/RIF methods， SAT， BACTEC MGIT960 cultivation and rifampicin （RFP） drug sensitive test respectively. The sputum specimens of MTB-RNA positive and RFP resistant which rely on the Xpert MTB/RIF identification at the same time were detected by SAT again After 72 hours of RFP drugs sterilization， the testing results of Xpert MTB/RIF joint SAT were comparison analyzed with BACTEC MGIT960 susceptibility results. Result： A total of 56 cases sputum specimen of RFP resistant were detected by Xpert MTB/RIF， 44 cases RFP resistant MTB in sputum specimens were identified by BACTEC MGIT960. A total of 50 cases sputum specimen of MTB-RNA positive and RFP resistant at the same time were detected by SAT and Xpert MTB/RIF， among only 46 cases sputum specimen of MTB-RNA positive were detected by SAT after 72 hours of RFP action， the results slightly higher than BACTEC MGIT960 susceptibility， there were no statistically significant differences （字2=0.25， P>0.05）. Conclusion： The heterogeneity drug resistance MTB can be quickly detected by MTB/RIF joint SAT technology. It has important reference value for timely and accurate develop anti-tuberculosis treatment scheme.

利福平（RFP）是目前最重要的一線抗結核藥物，但近年來耐RFP結核病有逐年上升趨勢，國內外對耐RFP結核病非常重視，并將其列入耐多藥結核病診治范疇（簡稱RR-TB）[1-2]。如果能早期診斷耐RFP結核病并即時調整治療方案，可能會避免低頻率、低耐藥MTB逐步演變成高耐藥、耐多藥甚至全部耐藥MTB，從而提高治愈率，降低治療成本和減輕患者身心痛苦。相對于檢測耗時過長的羅氏培養及比例法藥敏技術和價格昂貴、推廣受到限制的自動化表型藥敏檢測技術BACTEC MGIT960[3]，目前已推廣并廣泛應用至國內地市級以下醫院的Xpert MTB/RIF檢測技術，僅需要幾小時就能自動篩查出標本中是否存在MTB及RFP耐藥情況，即使存在比例較低異質性耐RFP的MTB也能被有效檢測到，已成為早期快速診斷耐RFP結核病最有效的自動化分子藥敏檢測技術[4-5]。但在檢測臨床標本過程中發現Xpert MTB/RIF和表型藥敏檢測結果方面存在一定差異[6]，可能會對制訂抗結核方案帶來困惑。筆者嘗試利用Xpert MTB/RIF聯合SAT技術（RNA恒溫擴增實時檢測法）來快速檢測痰標本中耐藥MTB，來彌補Xpert MTB/RIF檢測不足，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 菌株來源 MTB標準株（H37Rv ATCC27294）購自國家菌種保藏中心，172例涂陽痰標本來自2015年2月-2017年10月在南通市第六人民醫院就診的復治肺結核患者。其中男110例，女62例，年齡22～82歲，平均（49.5±2.0）歲。對每例復治肺結核患者均詳細記錄用藥史、癥狀及胸部影像學檢查情況。

1.1.2 主要試劑和儀器 iddlebrook 7H9培養基干粉、OADC營養添加劑、Bactec MGIT檢測儀、Bactec MGIT試劑[購自美國BD（Becton Dickinson）公司];RFP購自美國Fluka公司;GNP-92700隔水式培養箱購自上海精宏實驗設備有限公司;Gene Xpert儀器及Xpert MTB/RIF檢測試劑盒購自美國Cepheid公司;MTB核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴增，商品名TB-SAT）、分枝桿菌超聲破碎儀購自上海仁度生物科技有限公司;ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司生產）。

1.2 方法

1.2.1 抗酸染色涂片 檢測操作按照文獻[7]《結核病診斷實驗室檢驗規程》中的標準化操作程序進行操作。痰抗酸桿菌菌量按萎-尼染色鏡檢結果菌量分級標準以1+、2+、3+、4+記錄，其中20例標本1+，37例標本2+，63例標本3+，52例標本4+。

1.2.2 標本處理 取干酪樣或膿樣晨痰1 ml于試管內，加入4%NaOH 4 ml并進行振蕩使痰液充分消化，移入37 ℃水浴箱，15 min后用1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中和，3 000 r/min離心，30 min后移入37 ℃水浴電熱恒箱內。

1.2.3 BACTEC MGIT960 按照BACTEC MGIT960操作說明，進行分枝桿菌液體培養、菌型鑒定及RFP藥敏試驗（培養基的RFP藥物終濃度為1.0 μg/ml），儀器在一定時間內自動報告敏感與耐藥結果。質量控制：每次藥敏試驗均采用H37Rv標準株作為陽性參照。

1.2.4 Xpert MTB/RIF核酸擴增檢測 按試劑說明書將之前處理后標本加入檢測反應盒，上機進行檢測，系統自動進行檢測和結果判斷，2 h內判斷標本內是否存在MTB及是否對RFP耐藥，反應結束后在檢測系統窗口下直接觀察測試結果。結果報告為：MTB檢出或未檢出，檢出菌量報告結果為高、中、低、極低;MTB檢出報告同步顯示RFP耐藥的結果：△CT≥3.5，RFP耐藥;△CT<3.5，RFP敏感（CT是指探針循環域值，△CT指探針早期CT值與晚期CT值之差），耐藥檢測探針分別為：probe A、probe B、probe C、probe D、probe E。

1.2.5 TB-SAT檢測 根據試劑盒說明書進行操作，將液化好的結核標本進行稀釋，再用超聲波處理儀進行超聲處理15 min。超聲結束后，取2 μl處理標本加入30 μl擴增檢測液中，開啟恒溫熒光檢測儀器進行檢測。

1.2.6 其他 痰標本RFP處理后再進行TB-SAT檢測，流程參照文獻[8]進行：取0.5 ml痰處理標本分別接種至對照管（不含藥物）及加藥管（RFP終濃度為1 μg/ml）的7H9液體培養基中，培養管總體積為1 ml，37 ℃培養72 h，進行SAT檢測。

1.3 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計學處理，計數資料采用率（%）表示，兩組間比較采用字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 172例涂陽痰標本檢測結果

BACTEC MGIT960培養報告陰性標本18例，陽性標本154例;4例鑒定為非結核分枝桿菌，150例鑒定為MTB，藥敏結果顯示耐RFP 44例。Xpert MTB/RIF檢測到167例，檢出菌量報告結果為高87例，中38例，低34例，極低8例;檢出耐RFP 56例，菌量報告結果為高20例，中16例，低14例，極低6例;probe D及probe E檢測結果共40例，占71.4%。SAT檢測報告MTB-RNA陽性154例。56例耐RFP標本中菌量與探針結果關系見表1。

2.2 Xpert MTB/RIF、Xpert MTB/RIF+SAT與BACTEC MGIT960在檢測RFP耐藥結果的差異比較

單獨利用Xpert MTB/RIF檢測到耐RFP標本56例，與BACTEC MGIT960診斷RFP耐藥有差異性標本13例，多見于耐藥基因突變，多為探針A、B、C探查結果或者含二線方案治療中>3個月的患者痰標本，見表2;Xpert MTB/RIF檢測到耐RFP標本56例中同時SAT檢測報告MTB-RNA陽性有50例，將這50例MTB-RNA陽性標本經過RFP作用72 h后再進行SAT檢測，報告MTB-RNA陽性標本46例，與BACTEC MGIT960同時診斷RFP耐藥為43例，有差異性標本4例，差異無統計學意義（字2=0.25，P>0.05），見表3。

3 討論

耐RFP結核病有賴于早期診斷和有效治療，但耐RFP結核病形成是一個緩慢的過程，即低耐藥MTB從零星出現逐步演變成高暴露、高耐藥MTB過程，對這個過程中不同時間的痰標本進行檢測可能出現分子藥敏和表型藥敏不一致性[9]，因此如果能早期檢測出復治肺結核患者痰標本MTB中低頻率的RFP異質性耐藥菌，可能成為提高其治愈率、減輕致殘率的關鍵。常規MTB藥敏試驗方法，如羅氏培養及藥敏試驗耗時過長不能滿足臨床需要，自動化BACTEC MGIT960表型藥敏檢測方法因價格問題無法推廣應用。而近年來臨床廣泛應用檢測MTB及RFP耐藥的Xpert MTB/RIF分子藥敏技術采用半巢式PCR，針對rpo B基因81 bp RFP）耐藥決定區設計了5個分子信標探針（以probe A、probe B、probe C、probe D、probe E命名），以檢測標本中是否存在MTB及是否對RFP耐藥，是將MTB的DNA提取、PCR擴增和熒光檢測結合在一起，并自動報告結果的檢測系統，國內外應用Xpert MTB/RIF檢測MTB及其RFP耐藥報道較多[10-12]。

筆者在臨床應用過程中發現利用Xpert MTB/RIF診斷RFP耐藥雖然快速，僅需要3 h就能得到結果，但利用Xpert MTB/RIF檢測的結果與BACTEC MGIT960仍然有一定差異。進一步對檢測耐RFP的MTB分子信標探針結果進行對比發現，probe D及probe E探針結果共40例，占71.4%，probe A、probe B及probe C探針結果共15例，而probe A、probe B探針檢測到基因突變片段可能為低耐藥或無意義突變[13];同時在實際檢測過程中發現患者送檢痰標本的時間節點不盡相同，即部分患者留取痰標本前可能進行了有效用藥，長時間、廣覆蓋的治療可能會造成涂陽痰標本中MTB狀態多樣性，如活菌、DNA未降解的死菌，L型MTB等;而Xpert MTB/RIF是基于MTB的DNA提取、PCR擴增為基礎的，意味著對患者痰標本中各種狀態的MTB都能進行有效檢測，不能區別死菌和活菌;同時Xpert MTB/RIF檢測標本中異質性耐藥結核菌存在一定閾值限制，本實驗組通過臨床實驗發現，如標本中RFP耐藥MTB低于15%的比例，Xpert MTB/RIF檢測rpo B基因突變的能力明顯減低。因此Xpert MTB/RIF能快速檢測到標本中MTB存在rpo B基因突變，單獨依靠Xpert MTB/RIF檢測結果來制定治療方案存在一定的風險。

筆者就如何快速解決這一問題進行了認真探索，發現利用SAT-TB檢測技術檢測痰標本中MTB-RNA能有效彌補Xpert MTB/RIF不足。現正在推廣使用檢測MTB-RNA的新技術SAT-TB[14-15]，是以MTB特異的16srRNA為檢測靶標，通過恒溫擴增技術擴增RNA靶標片段，對熒光標記的探針與靶標片段的擴增產物雜交后釋放出熒光信號進行實時檢測，從痰標本處理到最終報告結果僅需幾小時，能快速準確地診斷檢測樣本中是否存在MTB，且SAT-TB只能檢測活的MTB，因為MTB死亡后RNA能快速降解[16]，不同于雙鏈結構的DNA有1～2個月才降解的超長平臺期。從本組利用SAT-TB檢測數據看，Xpert MTB/RIF檢測到耐RFP標本56例中同時SAT檢測報告MTB-RNA陽性有50例，表明有6例標本中MTB基本為死菌。將50例標本使用RFP殺菌72 h，即將標本中敏感MTB殺滅后再利用SAT檢測，結果有46例痰標本MTB-RNA為陽性，提示這46例標本中存在RFP耐藥MTB且為活菌，接近于BACTEC MGIT960藥敏結果（字2=0.25，P>0.05）。利用基于DNA的Xpert MTB/RIF聯合基于RNA的SAT-TB分子藥敏技術方案來快速檢測痰標本中RFP耐藥MTB，可以較準確判斷標本中MTB對RFP耐藥程度、耐藥菌是否為活菌，類似于分子藥敏結合表型藥敏技術，對快速制定抗結核治療方案和綜合評估治療效果有非常大的幫助，能基本滿足臨床的需要。

本檢測方案不足之處在于Xpert MTB/RIF僅能涵蓋rpoB基因81 bp RFP耐藥決定區，對可能存在耐藥決定區外少見基因突變或其他因素導致耐藥沒有鑒定能力[17-18];少量非優勢耐藥菌群活性差，利用RFP殺滅不活躍MTB可能要延長藥物作用時間后才能進行SAT-TB檢測，可能需要嘗試聯合其他實用、經濟的檢測技術或者優化相關檢測流程來完善檢測方案。總之，對于缺少像BACTEC MGIT960這種快速檢測MTB藥敏表型藥敏檢測儀器的基層單位，Xpert MTB/RIF聯合SAT檢測可以成為快速精準診斷RFP異質性耐藥優選方案之一。

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（收稿日期：2019-10-21） （本文編輯：何玉勤）