川栝樓瓤中次生代謝物組成及相對含量分析研究△

劉青，李珮，曾其國，馬藝沔，何春年，丁自勉*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.教育部中草藥物質基礎與資源利用重點實驗室，北京 100193；3.成都師范學院，四川 成都 611130

栝樓TrichosantheskirilowiiMaxim是葫蘆科Cucurbitaceae栝樓屬，為多年生藥食兩用、雌雄異株草質藤本植物[1]，而川栝樓(川瓜蔞1號)為栝樓T.kirilowiiMaxim的一個品種，主要種植于四川省[2]。中醫稱栝樓為瓜蔞，其果實、果皮和種子均被《中華人民共和國藥典》收載，分別以瓜蔞、瓜蔞皮、瓜蔞仁(及炒瓜蔞仁)為藥用，功效各異[3]。綜合歷代本草記載，瓜蔞具有清肺潤燥、滌痰寬胸、利氣開郁、滌痰散結、甘潤解渴、潤燥滑腸、清熱消腫散結等功效(見表1)[4-6]。中醫用于胸痹證、消渴、腸燥便秘、乳癰等[7-9]。現代中西醫結合用于治療冠心病、糖尿病等[10-15]。四川是栝樓的重要產區[16]，主要種植品種為“川瓜蔞1號”，也稱為“川栝樓”。川栝樓作為農民藥用植物脫貧致富的新資源，產量巨大，在生產過程栝樓瓤通常作為廢棄物被拋棄，造成資源浪費和環境污染。對栝樓瓤的藥理作用及其成分的研究報道尚少，為了綜合利用川栝樓藥用資源，本研究通過對川栝樓不同部位的成分進行檢測，并將栝樓瓤與藥用部位的栝樓皮和栝樓仁進行比較分析，以揭示川栝樓瓤的差異化學成分及相對含量，為栝樓瓤的開發利用提供科學數據和參考依據。

1 材料

1.1 樣品環境概況

蒼溪縣地處四川盆地北緣、大巴山南麓之低、中山丘陵地帶，介于東經105°43′～106°28′與北緯31°37′～32°10′，幅員2 346.46 km2。受米倉山、大巴山構造控制，地勢由東北向西南傾斜，山脈呈北、北東弧形走向，最高九龍山主峰海拔1 377.5 m，回水、石門、歧坪一線以南為低山深丘區，山丘多呈桌狀及臺階狀，沿江可見沖積層階地，境內江河縱橫，切割劇烈，地形復雜，嶺陡谷深，平壩、臺地、丘陵、低山、低中山及山塬地貌皆有[17]。低山丘陵最適宜川栝樓的生長，本研究樣品采集為蒼溪縣陵江鎮玉女村川栝樓生產基地的鮮果，儲藏并保鮮送中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所檢測分析。

1.2 樣品處理

將部分栝樓鮮果切開，分成皮、瓤、仁及全果4個部分作為樣品實驗(見圖1)，先將4類樣品用鼓風干燥箱在50 ℃下干燥36 h左右，栝樓仁、栝樓皮基本烘干，從干燥箱中取出，放冷，粉碎；栝樓瓤和全果含水量較多，將其轉移至真空干燥箱，在50 ℃下繼續干燥50 h，全果樣品取出后粉粹；栝樓瓤干燥后具有一定的黏度，轉移至冰箱中，在-20 ℃條件下放置2 h左右，用研缽將其搗碎，搗碎后的樣品栝樓、栝樓皮、栝樓瓤和栝樓仁分別用F、P、N和S進行分類編號。

1.3 儀器

Dionex UltiMate 3000(Thermo Fisher科技有限公司)；Acquity UPLC SynaptG2 HDMS系統(美國Waters公司)；AL204型梅特勒-托利多萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；超純水儀(Millipore公司)；數控超聲波清洗器(KQ5200DE型，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.4 試劑

甲醇、二氯甲烷(分析純，北京化工廠)；超純水(Millipore，法國)；甲醇(色譜純，Honeywell)；3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇對照品(成都普瑞法科技開發有限公司，純度：98%，批號：PRF8112821)。

表1 瓜蔞不同部位的藥理作用

圖1 川栝樓樣品處理

2 方法

2.1 高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)含量測定

按照2015版《中華人民共和國藥典》(一部)栝樓含測項下進行檢測[3]。

2.1.1色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇∶水=93∶7；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL；檢測波長：230 nm。

2.1.2對照品溶液配制 取 3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇對照品約1 mg，精密稱定，加入二氯甲烷配制對照品溶液，質量濃度為0.13 mg·mL-1。

2.1.3供試品溶液的制備 精密稱取栝樓各部位干燥粉末約1.0 g，置量瓶中，加入二氯甲烷至刻度線下約1 cm處，超聲提取30 min，取出，放冷，二氯甲烷定容至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜過濾，取續濾液。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS代謝物測定

2.2.1色譜條件 Waters HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)。流動相(A)為1%甲酸水，流動相(B)為乙腈，梯度洗脫程序(0～8 min，2%～25%B；8～10 min，25%～30%B；10～14 min，30%～100%B；14～15 min，100%～100%B；15～16 min，100%～2%B；16～19 min，2%～2%B)。柱溫為30 ℃，流速為0.3 mL·min-1。進樣體積2 μL。檢測波長：210～400 nm。

2.2.2質譜條件 采用電噴霧負離子檢測電離模式，霧化氣為高純度N2，碰撞氣為高純度He，質量掃描范圍：m/z100～1200。負離子模式錐孔電壓：40 V，毛細管電壓：2.4 kV，離子源溫度：100 ℃，脫溶劑氣溫度：350 ℃，脫溶劑氣流速：900 L·h-1，錐孔氣體流量：50 L·h-1，碰撞能量(CE)：20～40 V，LockMass：亮氨酸腦啡肽，m/z為554.261 5。

2.2.3提取方法 1)精密稱取栝樓各部位干燥粉末約1.0 g，置量瓶中，加入甲醇25 mL，超聲提取30 min，取出，放冷，甲醇定容至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜過濾，取續濾液，備用；2)取一定量上述提取液混合均勻，得到質控(QC)溶液。

2.2.4數據處理 將超高效液相色譜-質譜聯用(UPLC-Q-TOF-MS)得到的樣品數據導入Waters Masslynx 4.1軟件中，在MakerLynx application manager Version 4.1編輯，進行峰識別、峰對齊、基線校正和歸一化等預處理，輸出三維數據矩陣(由保留時間、精確分子量和峰面積組成)，最后將得到的矩陣導入Simca-P軟件(13.0版本)進行主成分分析和偏最小二乘法判別分析等，對栝樓植物的不同部位進行模式識別，尋找組間差異較大的植物代謝物。

3 結果

3.1 栝樓果不同部位3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇的含量分析

含量測定結果見表2，研究結果表明：栝樓及不同部位(栝樓皮、瓤、仁)中均含有3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇[18-19]，含量存在一定的差異，其中栝樓全果的平均質量分數為0.30%，瓤中平均質量分數最高為0.39%，皮和仁的平均質量分數為接近為0.29%和0.28%，顯然栝樓瓤的3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇含量最高，即栝樓瓤>栝樓>栝樓皮>栝樓仁。檢測結果顯示不同部位中3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇含量與栝樓成熟度有一定的關系，未完全成熟栝樓瓤中的3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇質量分數最高為0.42%，高于全果的含量，栝樓仁中的質量分數最低為0.25%；栝樓完全成熟時，栝樓仁中的3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇的質量分數最高為0.36%，栝樓皮中的3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇的質量分數最低為0.26%，即栝樓仁>栝樓瓤>栝樓>栝樓皮。

表2 栝樓果不同部位3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇的含量

注：F為栝樓全果；P為栝樓皮；N為栝樓瓤；S為栝樓仁；1～4分別為代表4個不同栝樓果；其中：1～3號未完全成熟；4號完全成熟。*括號內值表示1～3號統計平均值。

3.2 栝樓果不同部位的差異代謝產物分析

3.2.1實驗的質控評估 首先使用無監督的主成分分析(PCA)對QC樣本及其他實驗樣本進行分析。QC樣本成分相同，在PCA得分圖中應當聚集在一起。圖2的PCA得分圖顯示，QC樣本緊密聚集，表明實驗方法穩定，系統重復性較好，因此對本實驗所采集的數據進行了下一步分析。

注：1.QC樣本；2.其他樣本。圖2 QC樣本與其他樣本PCA得分圖

3.2.2栝樓樣品不同部位代謝組學分析 不同部位的栝樓樣品通過UPLC-Q-TOF-MS分析所得基峰強度(BPI)色譜圖見圖3，圖中顯示栝樓的不同部位樣品的色譜圖有較明顯差異，但仔細對比發現，大多數色譜峰相同，只是相對含量有差異；栝樓瓤中的次生代謝產物含量豐富，與栝樓皮和栝樓仁的次生代謝物相比而言，栝樓瓤中大多數均含有次生代謝物，只是相對含量高低不同，特別是在高極性部分(保留時間4.5 min以前)，色譜峰較多(但色譜峰形不好，可能為多種成分疊加造成)。

為了研究栝樓不同部位之間主成分的差異，本實驗利用統計學軟件Simca-P(13.0版本)對數據做進一步處理。將干燥處理的栝樓樣品按照不同部位分為3組，分別為栝樓瓤、栝樓皮和栝樓仁(n=3)，繼續分析栝樓瓤中的次生代謝產物，并分別進行兩兩比較，以尋找不同部位間的差異性次生代謝產物。

統計分析發現栝樓瓤含有鳥嘌呤(C5H5N5O)和鳥苷(C10H13N5O5)，而栝樓皮中則未檢出；anillic acid/ isovanillic acid/4-hydroxy-2-methoxy-benzoic acid(C8H8O4)在栝樓瓤的含量小于栝樓皮；三萜皂苷(C38H56O13)的含量栝樓瓤大于栝樓皮(見表3)。

統計分析(見表4)發現在栝樓瓤含有三萜皂苷(C38H56O13)，而栝樓仁中則未檢出；在栝樓仁含有1，4-O-diferuloylsecoisolariciresinol(C40H42O12)，而栝樓瓤中則未檢出；鳥苷(C10H13N5O5)栝樓瓤的含量大于栝樓仁。

統計分析(見表5)發現在栝樓仁中含有1，4-O-diferuloylsecoisolariciresinol(C40H42O12) hanultarin(C30H34O9)和anillic acid/ isovanillic acid/4-hydroxy-2-methoxy-benzoic acid(C8H8O4)，而栝樓皮中則未檢出；在栝樓皮中含有vanillic acid、isovanillic acid、4-hydroxy-3-methoxy-benzoic acid(C8H8O5)，而栝樓仁中則未檢出。

注：從上至下依次為仁、皮、瓤。圖3 栝樓不同部位樣品UPLC-QTOF-MS分析BPI色譜圖

表3 栝樓瓤和栝樓皮的差異代謝物含量

序號tR[M-H]-VIP值化合物鑒定化學式皮/瓤12.210 2130.086 75.40??22.477 4150.043 11.75Guanine鳥嘌呤C5H5N5O+33.150 2164.071 04.31??43.720 2167.034 52.46vanillic acid/isovanillic acid/4-hydroxy-2-methoxy-benzoic acidC8H8O4?52.028 2180.066 02.18??66.467 6241.118 31.73+72.477 4282.083 92.80Guanosine鳥苷C10H13N5O5+82.205 0292.139 72.48+912.213 2329.232 72.27??107.712 3365.159 82.37?117.292 8381.190 92.36?1214.065 9452.277 34.37-134.788 6467.130 22.55??1413.762 9476.276 21.56-1514.154 8480.308 33.92-1613.804 1504.308 31.56-177.677 4529.229 12.86??1814.154 3540.329 03.68-1913.803 8564.330 11.77-2013.819 4614.330 22.49-2111.533 7719.363 81.82arvenin I/opercurins A三萜皂苷C38H56O13??2211.995 4761.374 18.99?2312.035 1763.389 33.65?2411.993 6807.379 41.55?

注：+表示瓤含有而皮中未檢出；-表示瓤中未檢出而皮含有；**表示瓤/皮>1，*表示瓤/皮<1，下同。

表4 栝樓瓤和栝樓仁的差異代謝物含量

續表4

表5 栝樓仁和栝樓皮的差異代謝物含量

3.2.3PCA分析及載荷矩陣 用Masslynx 4.1分析處理后。將其質荷比、保留時間和峰面積組成的三維矩陣導入Simca-P軟件(13.0版本)進行下一步分析，結果見圖4。

通過對栝樓3個不同部位(皮、瓤和仁)的代謝組學分析，可知栝樓不同部位的次生代謝產物有明顯差別(見圖4)，栝樓(N：瓤，P：皮)樣品PCA分析圖 PC1：74.6%，PC2：12.9%；栝樓(S：仁，N：瓤)樣品PCA分析圖 PC1：72.2%，PC2：16.8%；栝樓(S：仁，P：皮)樣品PCA分析圖PC1：68.9%，PC2：18.9%。這些差別在PCA分析載荷矩陣投影圖也得以體現，主要是化學成分的相對含量存在差異。

4 討論

本研究基于栝樓化學成分含量測定和代謝組學進行分析，研究結果表明：栝樓瓤中含有較高的3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇成分；其次，發現栝樓瓤中成分雖然與皮和仁差異較大，但也含有豐富的與皮、籽相同的成分；再則，系統地揭示出栝樓不同部位(皮、瓤和仁)化學成分的差異性，進一步為栝樓藥理活性的研究奠定了理論基礎，同時也對栝樓瓤的開發利用具有科學的指導意義。

本研究結果能夠對栝樓中藥資源利用予以啟示，栝樓皮和栝樓仁作為2味藥材在方劑中分開使用，其傳統應用的功效不同，本實驗結果也表明它們的化學成分和含量有所不同，功效不同可能與之有關。另外，栝樓瓤除作為全果一起藥用外，生產基地把栝樓瓤作為廢棄物棄之， 既浪費藥用植物資源，又污染當地環境，栝樓瓤次生代謝產物與皮及仁中差異明顯。栝樓果不同部位間的藥理藥效是否存在差異，栝樓瓤能否作為栝樓皮或栝樓仁藥用的替代品，有待更多的學者深入研究。基于本研究的結果和相關文獻記載，針對栝樓瓤的開發利用，建議重點考慮食品和化妝品[20-21]方向，特別是化妝品可能是優先考慮的，一方面栝樓(瓜蔞)在歷史上有用于美白保膚的記載，另一方面主要是化妝品是外用產品，其安全性要求低于內服要求。

注：A.栝樓(N：瓤、P：皮)樣品PCA分析圖；B.栝樓(瓤、皮)PCA分析載荷矩陣投影圖；C.栝樓(S：仁、N：瓤)樣品PCA分析圖；D.栝樓(仁、瓤)PCA分析載荷矩陣投影圖；E.栝樓(S：仁、P：皮)樣品PCA分析圖；F.栝樓(仁、皮)PCA分析載荷矩陣投影圖。圖4 栝樓瓤、皮和仁不同部位間PCA分析圖與其載荷矩陣投影圖