載芬維A銨脂質體抑制A375黑素瘤細胞裸鼠皮下移植瘤的初步研究

崔艾麗 金玟言 金哲虎

延邊大學附屬醫院皮膚科，吉林延吉 133000

惡性黑素瘤是惡性度很高的腫瘤之一，好發于皮膚，盡管在皮膚腫瘤中發病率較低［1］，但是致死率很高，80%以上的皮膚癌死亡病例由黑素瘤導致［2］。目前手術仍是治療黑素瘤的主要手段，然而對于無法手術的患者，目前能使用的化療藥物效果十分有限。因此，亟待尋找新型有效且無毒的抗黑素瘤化療藥物。本課題組在前期實驗中已成功制備載芬維A 銨脂質體（4?HPR?L），并在體外實驗中證明 4?HPR?L 能有效抑制黑素瘤 A375 細胞、B16F10細胞的增殖并誘導其凋亡［3?4］。為了進一步驗證4?HPR?L 的安全性和有效性，我們建立黑素瘤荷瘤裸鼠模型，研究其在體內對黑素瘤的抑制作用。

材料與方法

一、材料

1.細胞來源：人黑素瘤細胞A375 來自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。

2.動物來源：SPF 級BABL/c 健康裸鼠（雌性，4～6 周齡，14～16 g），產自北京維通利華實驗動物技術有限公司［生產許可證號：SCXK（京）2016?0006］，于層流架中飼養，2016—2017 年在中國醫學科學院藥物研究所動物房屏障環境動物實驗室進行實驗，動物實驗許可證號SYXK（京）2014?0023。實驗開始前所有動物在動物房適應1 周。實驗過程均按照國家質量監督檢驗檢疫總局聯合中國國家標準化管理委員會發布的《實驗動物、動物實驗通用要求》進行。

3.試劑與儀器：4?HPR 產自美國 Sigma?aldrich公司，純度98%；細胞膜近紅外熒光探針（DiR）產自海德創業（北京）生物科技有限公司。脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）檢測試劑盒來自美國羅氏公司。Heppar?1 抗體、Melan?A 抗體產自北京中杉金橋生物技術有限公司。旋轉蒸發儀（R?210）產自瑞士BUCHI 公司，超聲波細胞粉碎機（JY92?IIN）產自寧波新芝生物科技股份有限公司，小動物活體成像儀（IVIS live imaging system 100）產自美國Xenogen公司。

二、方法

1.制備4?HPR?L：采用薄膜-超聲分散法，具體步驟參考文獻［3］。

2.A375 黑素瘤細胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立：取對數生長期A375 細胞，胰酶常規消化離心，用冷PBS重懸、計數細胞，最后用不含胎牛血清的高糖 DMEM 培養基重懸，調整細胞為 1.0 × 107/ml。每只裸鼠右腋窩下接種0.2 ml 細胞懸液，每天觀察腫瘤生長情況，用游標卡尺動態測量并記錄瘤塊大小，稱取體重并記錄。腫瘤體積（V）=0.5×L×D2，其中L為腫瘤長徑，D為腫瘤短徑。

3.DiR和DiR脂質體（DiR?L）在體內的分布：腫瘤體積達到500 mm3時，選出瘤塊體積均等的荷瘤裸鼠 10 只，隨機分為 DiR 組和 DiR?L 組，每組 5只。藥物制備過程：將DiR 溶于二甲基亞砜，配制0.1 g/L DiR 溶液；采用薄膜-超聲分散法包裹DiR制備DiR?L，避光、低溫保存。通過尾靜脈單次給予 DiR 和 DiR?L，劑量為 10 μg/kg，注射量為 0.2ml。應用成像儀于注射后第6、12、24 h觀察DiR和DiR?L在腫瘤及組織中的熒光信號，拍照并記錄。給藥24 h 后，頸椎離斷法處死荷瘤裸鼠，解剖分離心、肝、脾、肺、腎、腫瘤，置于6 孔板中，用成像儀觀察離體器官和腫瘤中的熒光信號強度，拍照并記錄。小動物成像相關參數設置如下：激光濾光片745 nm，發射濾光片800 nm，曝光時間0.2 s，Bin值為4。圖像處理軟件為Living Imaging Software（Version 4.3.1）。

4.4?HPR?L 體內抑制黑素瘤生長實驗：待荷瘤裸鼠腫瘤生長至100 mm3時（接種后第8 天），選出瘤塊體積均等的30 只，隨機分為對照組、4?HPR 組和 4?HPR?L 組，每組10 只，分別經尾靜脈每次注射5%（質量分數）葡萄糖注射液0.2 ml、25 mg/kg 4?HPR和4?HPR?L，共給藥8次，分別于接種后第8、10、12、14、16、18、20、22 天給藥，每次給藥前測量體重和腫瘤長徑、短徑，計算體積。末次給藥后第2 天測定體重和腫瘤體積，然后頸椎離斷法處死荷瘤裸鼠，解剖取出心、肝、脾、肺、腎及腫瘤組織，稱取腫瘤重量后浸泡于4%中性甲醛溶液中固定72 h，常規石蠟包埋、切片，進行后續檢測。另取30 只同等情況荷瘤裸鼠按同樣方法分組及給藥，飼養至全部死亡，統計、繪制裸鼠生存率曲線。

5.病理檢查：

（1）HE 染色及 TUNEL 檢測：按照常規方法對心、肝、脾、肺、腎、黑素瘤組織進行HE 染色。黑素瘤組織石蠟切片脫蠟至水，修復，破膜，按照TUNEL試劑盒說明書步驟檢測。蘇木素染色后細胞核為藍色，DAB 顯現出來的凋亡細胞核為棕黃色顆粒，即為TUNEL 陽性細胞。每張切片隨機選取5 個不重疊高倍視野，采用Image pro plus 6.0 圖像分析軟件分析。計算每個視野的凋亡指數，然后取平均值。凋亡指數=陽性細胞面積/整個視野面積×100%。

（2）免疫組化檢測Heppar?1 和 Melan?A 在荷瘤裸鼠肝臟組織的表達：將裸鼠肝臟組織石蠟切片脫蠟至水，30%過氧化氫溶液暴露抗原決定簇，微波修復，冷卻至室溫，用5%牛白蛋白封閉后加入一抗（Heppar?1 和 Melan?A 抗體）4 ℃過夜。次日清洗一抗，滴加二抗（山羊抗小鼠IgG 聚合物）37 ℃孵育30 min，充分洗滌后DAB 顯色，蘇木素復染2 min，自來水沖洗，脫水，樹膠封片，顯微鏡下檢查，細胞質著色為棕黃色或黃褐色為陽性表達。

三、統計學分析

結果

一、A375黑素瘤細胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立

裸鼠右腋下接種A375 細胞后第8 天，皮下長出體積為100 mm3的瘤塊，經組織病理檢查證實為黑素瘤。

二、DiR和DiR?L在體內的分布

荷瘤裸鼠給藥后藥物在體內的分布見圖1、2。DiR?L 組在相同時間點吸收藥物較快，在移植腫瘤部位的熒光較強，并且在給藥24 h后腫瘤部位仍可以看到較強的熒光信號。兩組離體器官和腫瘤組織內熒光信號分布見圖3。在所有離體組織和腫瘤中，肉眼可見10 只小鼠腫瘤和肝臟組織內均有較強的熒光信號，而心、脾、肺、腎組織未見明顯熒光信號。熒光定量分析顯示，DiR?L 組腫瘤組織內的熒光強度（22.85 ± 1.66）顯著高于DiR 組（8.45 ±0.97，t= 12.96，P＜ 0.01），與在體小動物成像的結果一致。

三、4?HPR?L體內抑制黑素瘤生長的作用

1.體重變化：見圖4。對照組和4?HPR 組在給藥后早期體重變化不十分明顯，但在后期出現下降，4?HPR?L組體重呈穩定上升趨勢。

2.腫瘤體積變化以及離體瘤塊重量：見圖5、6。與對照組和 4?HPR 組相比，4?HPR?L 組腫瘤體積生長曲線比較平緩，增長緩慢。4?HPR?L 組離體瘤重為（0.69 ± 0.12）g，對照組為（1.55 ± 0.19）g，4?HPR 組為（1.12 ± 0.11）g，差異有統計學意義（F=27.055，P＜ 0.05），4?HPR?L 組與后兩組比較，t值分別為4.77、6.64，均P＜ 0.05。

3.4?HPR?L 對荷瘤裸鼠生存率的影響：見圖 7。對照組裸鼠于接種后 56 d 內、4?HPR 組在59 d 內全部死亡，而 4?HPR?L 組全部死亡時間最長，為76 d。

四、病理檢查結果

圖1 DiR 組和 DiR?L 組荷瘤裸鼠同時給藥后 6、12、24 h 體內藥物分布 DiR?L 組腫瘤部位熒光信號強度在相同時間點明顯高于DiR 組。右側標尺顏色越淺代表熒光強度越強。DiR：細胞膜近紅外熒光探針；DiR?L：DiR脂質體

圖2 DiR 組和DiR?L 組荷瘤裸鼠給藥后6 h 藥物在體內分布的三維立體圖 DiR?L 組腫瘤可見明顯熒光，DiR 組腫瘤未見明顯熒光。右側標尺顏色越淺代表熒光強度越強。DiR：細胞膜近紅外熒光探針；DiR?L：DiR脂質體

圖3 DiR 組和DiR?L 組離體器官和腫瘤組織內熒光信號比較 DiR?L 組離體腫瘤部位熒光信號強度明顯高于DiR 組。DiR：細胞膜近紅外熒光探針；DiR?L：DiR脂質體

圖4 不同給藥組荷瘤裸鼠的體重-時間變化曲線 4?HPR：芬維A銨；4?HPR?L：載芬維A銨脂質體

1.HE 染色觀察黑素瘤轉移情況：3 組裸鼠心、脾、肺、腎組織均未發現轉移灶，但在肝臟中發現轉移灶。對照組10只和4?HPR組10只裸鼠全部發生肝轉移，而 4?HPR?L 組 10 只中只有 2 只發生肝轉移，且轉移灶的面積、數量明顯少于其他兩組。各組裸鼠肝臟HE 染色結果見圖8。對照組和4?HPR組裸鼠肝臟內可見多處單個、巢狀排列及分布不規則的腫瘤細胞團，腫瘤細胞呈圓形或卵圓形，核深染，細胞異形性明顯，可見病理性核分裂象；4?HPR?L組肝細胞核呈紅色，未見腫瘤細胞。

圖5 不同給藥組荷瘤裸鼠腫瘤體積-時間變化曲線 4?HPR：芬維A銨；4?HPR?L：載芬維A銨脂質體

圖6 不同給藥組荷瘤裸鼠離體腫瘤體積比較 4?HPR?L 組腫瘤體積明顯小于對照組和4?HPR組。4?HPR：芬維A銨；4?HPR?L：載芬維A銨脂質體

圖7 不同組黑素瘤荷瘤裸鼠生存曲線 3組中4?HPR?L組裸鼠全部死亡時間最長。4?HPR：芬維 A 銨；4?HPR?L：載芬維 A 銨脂質體

圖8 各組裸鼠黑素瘤肝臟轉移情況 對照組和4?HPR 組肝臟內可見腫瘤細胞團，腫瘤細胞呈圓形或卵圓形，核深染，細胞異形性明顯，可見病理性核分裂象；4?HPR組未見明顯的核分裂象。4?HPR：芬維A銨；4?HPR?L：載芬維A銨脂質體

2.免疫組化法驗證黑素瘤的肝轉移情況：Heppar?1 在荷瘤裸鼠轉移瘤周圍的正常肝組織中彌漫表達，而腫瘤細胞團中未表達，見圖9A。而Melan?A 在肝組織中黑素瘤轉移灶中彌漫陽性，在周圍正常肝組織中未表達，見圖9B。

3.TUNEL 法檢測結果：對照組凋亡指數為（12.14 ± 1.33）‰，4?HPR 組為（67.17 ± 15.18）‰，4?HPR?L 組為（152.73 ± 11.27）‰，3 組間差異有統計學意義（F= 167.59，P＜ 0.05），4?HPR?L 組與對照組和 4?HPR 組相比，t值分別為 18.16、11.07，均P＜ 0.05。

討論

圖9 免疫組化染色檢測荷瘤裸鼠黑素瘤肝轉移情況 9A：Heppar?1 在周圍正常肝組織中彌漫表達（箭頭示肝臟組織），而腫瘤細胞團中未表達；9B：Melan?A 在肝組織中的惡性黑素瘤轉移灶中彌漫陽性（箭頭示黑素瘤組織），在周圍正常肝組織中未表達

4?HPR 是一種維A 酸類衍生物，研究發現4?HPR 與傳統的維A 酸類化合物不同，其誘導分化作用較弱，促進腫瘤細胞凋亡的作用較強，毒性遠較其他維A 酸類化合物低，可長期使用，耐藥發生率低，并可單獨或聯用其他化療藥物抗腫瘤。近年國外一些研究顯示，4?HPR 對多種實體瘤如鱗狀細胞癌、肺癌、膀胱癌、白血病等［5?8］均有直接抑制作用。體外實驗表明，4?HPR 能夠干擾上述多種腫瘤細胞的生物學行為，發揮調節分化、抗侵襲、抑制生長、誘導凋亡的作用，有較好的治療前景［9?10］。但是，水溶性低及靶向性差等缺點導致4?HPR生物利用度低，限制其在臨床上的進一步應用。脂質體包載后的藥物具有毒性低、有助于減少用藥劑量等優點，并且能有效避免耐藥性，使被包封藥物得到有效保護，藥物釋放控制更有效。

我們成功建立黑素瘤A375細胞裸鼠皮下移植瘤模型，并對4?HPR?L 對黑素瘤的治療效果進行評估。先以親脂性的熒光染料DiR 為探針［11］，通過小動物活體成像儀觀察DiR 和DiR?L 進入裸鼠體內后不同時間點各臟器和腫瘤組織對藥物的攝取情況。因DiR 為脂溶性熒光染料，其疏水性及其他理化性質與4?HPR類似，而4?HPR本身不具備熒光性質［11］，因此選擇 DiR 替代 4?HPR 進行藥物靶向性觀察。結果顯示，熒光在肝臟中含量較高，即脂質體有肝、脾網狀內皮系統的靶向性；而DiR?L 組腫瘤部位的高熒光強度則說明，通過腫瘤的高通透性和滯留效應，藥物被動靶向地聚集在腫瘤部位，從而可更好地發揮藥效，并減少對其他組織細胞的損傷。

對不同給藥組荷瘤裸鼠體重的動態監測顯示，對照組和4?HPR組裸鼠體重增加不明顯，且后期開始下降，可能是腫瘤的惡病質和原料藥物本身對機體的系統毒性導致［12］。從給藥后各組裸鼠的腫瘤體積-時間曲線圖可以看出，4?HPR?L 對 A375 黑素瘤具有較強的生長抑制作用，且離體瘤塊重量與在體瘤塊體積數據也相一致。在末次給藥后第2 天，對照組和4?HPR 組所有裸鼠均發生了肝轉移，而4?HPR?L組只有2只發生肝轉移，其他臟器均正常，免疫組化顯示轉移灶Melan?A陽性，Heppar?1陰性，說明4?HPR?L 不僅抑制原發性腫瘤細胞效果良好，而且對預防腫瘤轉移同樣有良好的作用。TUNEL檢測結果證明，4?HPR?L 抑制腫瘤增殖的作用可能與誘導細胞凋亡作用有關。4?HPR?L 組荷瘤裸鼠生存期最長，說明4?HPR?L 較原料藥可以更有效地延長荷瘤裸鼠的生存期。

綜上所述，4?HPR?L 能夠有效抑制裸鼠皮下黑素瘤體積增長和黑素瘤細胞的轉移，并能延長裸鼠的生存周期，且未見動物體重明顯下降、重要臟器損傷等明顯不良反應，有望成為臨床上治療黑素瘤的一種新型藥物。但是本文只是通過被動靶向來治療黑素瘤，今后將進一步嘗試連接適當的靶向材料，使4?HPR?L 發揮主動靶向作用殺傷腫瘤細胞，從而起到更好地抑制腫瘤的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突