黃連素對博來霉素誘導肺泡上皮細胞形態及TGF-β1分泌水平的影響

皮玉琪，程立，胡先平

1錦州醫科大學國藥東風總醫院研究生培養基地，湖北十堰442000；2湖北醫藥學院附屬國藥東風總醫院

肺纖維化是由于過多的成纖維細胞聚集和細胞外基質(ECM)成分如膠原蛋白沉積而導致正常的肺組織結構改變、功能喪失的一類疾病。肺纖維化主要累及肺間質、肺泡和(或)細支氣管，表現為毛細血管內皮細胞與急性彌散性肺泡上皮細胞損傷，最終可導致呼吸衰竭，病死率為50%～70%[1,2]。近年來，肺纖維化的發病率呈上升趨勢，臨床上仍缺乏有效的治療手段。因此，尋找對肺纖維化有效的治療藥物已成為當前醫學的迫切需要。黃連素又稱小檗堿，是從黃連等植物中提取的活性生物堿。許多研究表明，黃連素具有保護心肌細胞、抗血小板凝集、減少血栓形成、修復內皮細胞、改善血管功能以及抗焦慮、鎮靜、降糖、降血脂、抗氧化自由基等作用[3，4]，除此之外，國內多項研究表明，黃連素可通過多種途徑抗心臟、肝臟、腎臟等多臟器纖維化進程[5～8]。目前對黃連素在肺間質纖維化進展中的作用研究多為大鼠實驗，關于黃連素對人肺泡上皮細胞的抗肺纖維化作用機制，以及黃連素抗博來霉素誘導肺間質纖維化的作用和機制，目前也尚未明確。博來霉素已臨床應用30余年，抗癌活性強，同時無明顯的骨髓功能和免疫功能抑制，但主要不良反應為肺纖維化，因此常被用于各種肺纖維化模型的誘導[9]。2018年8月～2019年2月，本研究以人肺泡上皮細胞A549作為研究對象，通過博來霉素誘導肺纖維化模型，觀察不同濃度黃連素處理A549細胞后細胞形態和轉化生長因子β1(TGF-β1)分泌水平的變化，初步探討黃連素抗肺纖維化的作用及機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 A549細胞[10]購于中國科學院干細胞庫，接種于含10% FBS的DMEM/F12培養基，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱中培養，1～2 d換液1次，細胞密度達80%時，用含0.25% EDTA-Na2胰酶消化，傳代。黃連素、MTT試劑購自Sigma公司，博來霉素購自浙江海正公司，人TGF-β1ELISA試劑盒購自欣博盛公司，FBS購自BI公司，DMEM/F12購自Gibco公司，DMSO購自MP公司。細胞保溫箱(Thermo公司)，全波段酶標儀(型號MQX-200)，倒置顯微鏡(OLYMPUS CKX41)。

1.2 博來霉素作用濃度篩選 消化對數生長期A549細胞，用不含FBS的DMEM/F12培養基處理成細胞懸液(排除FBS對細胞增殖的影響)，按5×104/mL、各取200 μL細胞懸液接種于96孔板，培養24 h后鋪滿孔底。將博來霉素溶解于PBS中，設置實驗組、對照組和空白組。實驗組分為6個亞組，分別加入含4、6、8、10、12.5、25 μg/mL博來霉素的DMEM/F12無血清培養基；對照組細胞在無血清培養基中培養，僅加PBS；空白組只有培養基和PBS，不含細胞。每組設置6個復孔。培養24、48 h后每孔加入MTT 20 μL繼續孵育4 h，吸棄上清，加入150 μL的DMSO，充分震蕩混勻15 min后用全波段酶標儀檢測各孔490 nm處光密度(OD)值，取均值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。結果顯示，博來霉素能夠顯著抑制A549細胞增殖，8、10、12.5、25 μg/mL博來霉素作用24、48 h后細胞增殖抑制率高于4 μg/mL濃度(P均<0.05)。其中，10 μg/mL博來霉素作用24 h時，細胞增殖抑制率在50%左右，選取此作用濃度用于肺纖維化誘導實驗。詳見表1。

表1 不同濃度博來霉素作用不同時間后A549細胞增殖抑制率比較

注：與同時點4 μg/mL濃度相比，*P<0.05。

1.3 細胞分組及黃連素給藥方法 將黃連素粉末溶解于DMSO中配制黃連素溶液，博來霉素溶于PBS中配制博來霉素溶液。將A549細胞分為博來霉素組、黃連素1組、黃連素2組、黃連素3組、黃連素4組、DMSO組、培養基組。博來霉素組加入10 μg/mL博來霉素，黃連素1、2、3、4組分別加入60、80、100、125 μmol/L黃連素和10 μg/mL博來霉素混合溶液，DMSO組加入DMSO，培養基組加入不含FBS的DMEM/F12培養基。

1.4 細胞形態觀察 分別于處理24、48 h后經倒置顯微鏡觀察各組細胞形態并拍攝照片。

1.5 細胞上清液TGF-β1檢測 分別于處理24、48 h后，取各組細胞培養液離心，取上清液分裝于1.5 mL的EP管在-20 ℃保存。采用ELISA法檢測TGF-β1，每組設置3個復孔，重復3次。根據ELISA試劑盒說明書操作。在空白孔中加入標準品和標本通用稀釋液，其余相應孔中加標本和不同濃度標準品(100 μL/孔)。用封板膠紙封住反應孔，37 ℃孵箱孵育90 min后洗板5次，在空白孔加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔)。用新的封板膠紙封住反應孔，37 ℃孵箱孵育60 min后洗板5次。在空白孔加酶結合物稀釋液，其余各孔加入酶結合物工作液(100 μL/孔)。用新的封板膠紙封住反應孔，37 ℃孵箱孵育30 min后洗板5次。加入顯色底物TMB(100 μL/孔)，避光37 ℃孵箱孵育15 min后加入終止液(100 μL/孔)，混勻后即刻用全波段酶標儀測量OD450值，根據結果制作標準曲線和標準濃度公式，并將各孔OD值帶入公式得出各組細胞上清液的TGF-β1濃度。

2 結果

2.1 各組細胞形態 培養基組培養24、48 h細胞呈三角形、鋪路石、鵝卵石樣，細胞大小均勻，排列緊密，無突觸及多角，胞內細胞質均勻透亮，細胞間無明顯間隙(圖1)。博來霉素組A549細胞培養24、48 h后細胞變小，細胞呈現梭形、紡錘形、扁大多形性，邊緣不規則，多有觸角，胞內細胞質不均勻，細胞間隙增加，處理48 h后變化更加明顯(圖2)。DMSO組培養24、48 h后細胞逐漸變大，可見較多大圓形細胞，細胞間隙增大，細胞核增大、高亮，胞質變少且不均勻(圖3)。黃連素1、2、3、4組培養24、48 h后細胞狀態與原始A549細胞相比均有不同程度改變，細胞逐漸趨向多角形、扁大形，但均較博來霉素組更加趨向于正常細胞，其中黃連素4組培養24 h細胞形態最趨向正常細胞(圖4～7)。

注：A為培養24 h細胞形態；B為培養48 h細胞形態。

圖1 培養基組培養24、48 h細胞形態

注：A為培養24 h細胞形態；B為培養48 h細胞形態。

圖2 博來霉素組培養24、48 h細胞形態

注：A為培養24 h細胞形態；B為培養48 h細胞形態。

圖3 DMSO組培養24、48 h細胞形態

注：A為培養24 h細胞形態；B為培養48 h細胞形態。

圖4 黃連素1組培養24、48 h細胞形態

注：A為培養24 h細胞形態；B為培養48 h細胞形態。

圖5 黃連素2組培養24、48 h細胞形態

注：A為培養24 h細胞形態；B為培養48 h細胞形態。

圖6 黃連素3組培養24、48 h細胞形態

2.2 各組細胞上清液中TGF-β1水平 博來霉素組、DMSO組培養24、48 h細胞上清液TGF-β1水平均高于培養基組(P均<0.05)。黃連素1、2、3、4組培養24、48 h細胞上清液TGF-β1水平均低于博來霉素組(P均<0.05)。黃連素3、4組培養24、48 h細胞上清液中TGF-β1水平低于黃連素1、2組(P均<0.05)。詳見表2。

注：A為培養24 h細胞形態；B為培養48 h細胞形態。

圖7 黃連素4組培養24、48 h細胞形態

表2 各組培養24、48 h細胞上清液TGF-β1水平比較

注：與培養基組相比，*P<0.05；與博來霉素組相比，#P<0.05；與黃連素1、2組相比，△P<0.05。

3 討論

肺纖維化的機制目前仍不十分明確，以往認為炎癥是導致肺纖維化的首要條件之一，近些年來大量研究報道，在特發性肺纖維化和間質性肺炎中，炎癥反應不一定是必要條件，而肺泡上皮-間充質轉化(EMT)及相關信號轉導通路在誘導肺纖維化中的作用逐漸得到認可[11]。

成年人肺中存在兩種肺泡上皮細胞，分別為Ⅰ型肺泡上皮細胞(AEC-Ⅰ)和Ⅱ型肺泡上皮細胞(AEC-Ⅱ)。AEC-Ⅰ為終末分化的細胞，覆蓋90%的肺泡表面；AEC-Ⅱ產生、分泌表面活性劑來維持肺泡張力，調節肺泡液平衡，并且在細胞凋亡或受到損傷時分化成AEC-Ⅰ來修復受損屏障[12]。修復過程中可能出現ECM的異樣沉積。ECM是細胞外分泌大分子的復雜網絡，例如膠原蛋白、酶和糖蛋白，其主要功能包括結構支架和細胞、組織的生化支持。ECM的穩態對于器官發育至關重要，ECM持續異樣沉積或失調會導致病理修復，進一步導致EMT[13]。

EMT是肺纖維化的關鍵過程，而肺泡上皮細胞作為哨兵和效應系統在EMT的過程中起著關鍵作用。在EMT的過程中有許多通路和細胞因子參與，如TGF-β信號通路、PI3K-AKT-mTOR信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、MAPK信號通路及NF-κB信號通路[14，15]。其中至關重要的細胞因子是TGF-β，TGF-β是一種多效性的細胞因子，可由多種細胞產生，調節細胞增殖、分化、遷移、黏附，調節ECM的代謝，參與肺胚胎發育、組織損傷和修復[16，17]。TGF-β有三種亞型即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1亞型與肺纖維化發生發展關系最為密切[18]。因此，減少TGF-β1的表達可能延緩肺纖維化進程[19]。

正常人肺泡上皮細胞常表現為鵝卵石、類方形等，細胞光滑無明顯突觸，連接緊密。而肺纖維化細胞常表現為紡錘形、長梭形、多形性伴有多觸角。本實驗通過博來霉素誘導24 h后的A549細胞有纖維化特點，可認為博來霉素誘導了肺泡上皮細胞纖維化。通過檢測各組細胞上清液中TGF-β1水平，我們發現，博來霉素組、DMSO組培養24、48 h細胞上清液TGF-β1水平均高于培養基組，證實了博來霉素具有誘導A549細胞纖維化的作用。DMSO是一種良好的溶劑，本實驗中黃連素必須溶于DMSO才可獲得均勻、溶解度好的溶液，博來霉素溶于PBS即可。PBS對細胞無損壞作用，但DMSO對細胞具有毒性作用。因此，我們設計了DMSO組用來排除不同溶劑溶解兩種藥物造成的誤差。DMSO組細胞上清液TGF-β1水平高于所有黃連素組，進一步表明黃連素可以降低DMSO對細胞的損傷。但DMSO組細胞形態與博來霉素誘導的肺纖維化細胞有所區別，其光鏡下細胞形態變化類似于一種病理性死亡的變化。

一項研究顯示，低濃度的TGF-β1可增加心臟成纖維細胞的活力，促進膠原Ⅲ的合成，而黃連素可呈濃度依賴性地抑制心臟成纖維細胞的活力，降低膠原Ⅲ的合成，促進p38-MAPK蛋白磷酸化[5]。孫斯凡等[6]研究證實，黃連素可減少大鼠腎皮質的TGF-β1、TβRI表達，上調smad7和IκBα的表達，從而減輕腎臟炎癥及纖維化。黃連素還能通過減少S1P2受體表達，抑制S1P2-MAPK(主要是ERK1/2和p38-MAPK)通路介導的纖維連接蛋白表達，發揮抗糖尿病腎纖維化的作用[20]。結合以上研究可知，黃連素可以通過多種信號途徑抗臟器纖維化，這些信號途徑也可能出現在肺組織中。

本研究結果顯示，黃連素藥物組細胞形態更加趨向于原始的鋪路石樣形態，且高濃度黃連素組細胞形態穩定性更好；黃連素1、2、3、4組培養24、48 h細胞上清液TGF-β1水平均低于博來霉素組，黃連素3、4組培養24、48 h細胞上清液中TGF-β1水平低于黃連素1、2組，這表明黃連素能夠抑制博來霉素誘導的A549細胞形態向多觸角形細胞改變，減少TGF-β1的分泌，并且隨著黃連素濃度增高、這種作用更加明顯，黃連素可能通過下調TGF-β1水平而達到抗肺纖維化的作用。

總之，本研究表明，黃連素可降低博來霉素誘導的A549細胞TGF-β1的分泌水平，并且黃連素濃度越高，保護細胞、延緩細胞纖維化的作用越強。我們認為，黃連素有望成為治療肺纖維化的新藥物。