急性缺血性腦卒中患者妊娠相關血漿蛋白A超敏檢測方法的建立及評價

曾昭偉，陳淑蓮，常艷敏，王學謙

(天津市南開醫院 檢驗科，天津300100)

急性缺血性腦卒中(IS)是臨床上常見的心血管系統疾病之一，當血管內皮細胞損傷后釋放炎性介質并形成易損斑塊，導致血管病變，促進IS進展[1]。妊娠相關蛋白A(PAPP-A)是一種基質金屬蛋白酶，在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中起重要作用，是心血管系統炎性疾病的生物標志物之一[2]。但在動脈粥樣硬化患者血清中的PAPP-A濃度極低[3]，普通ELISA方法難以檢測。由于IS是頸動脈粥樣硬化斑塊發生不穩定、破裂，引起血小板黏附、活化、聚集和血栓形成導致，所以推測PAPP-A是IS的潛在生物標志物，已有少量相關研究[4]支持這一理論。本研究制備基于活性表位集中的特異PAPP-A重組抗原，建立基于微球、生物素標記的PAPP-A與化學發光結合的超敏檢測方法，并對IS發生發展時PAPP-A檢測的臨床意義進行初步評估。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1臨床資料 收集天津市南開醫院2017年6月至2018年6月收治確診的神經內科IS患者血清。包括輕度患者39例，男23例，女16例，平均年齡(56±11)歲；中度患者43例，男24例，女19例，平均年齡(65±9)歲，重度患者患者36例，男20例，女16例，平均年齡(52±12)歲。對照組40例，男27例，女13例，平均年齡(58±16)歲。診斷均經CT/MRI檢查確診。排除標準：肝腎功能不全、嚴重的心力衰竭、心肌梗死、心源性腦栓塞、顱內出血、近1個月內有外傷史或手術史、腫瘤性疾病、急性感染性疾病、風濕性疾病等。

1.1.2試劑與儀器 Lica research 化學發光分析儀(中國上海博陽生物技術有限公司)、96孔發光微孔板、受體微球及鏈霉素親和素包被供體球均購自美國Perkin Elmer公司。定值標準品由Perkin Elmer公司提供，PAPP-A標準品濃度分別為0 mU/L、10 mU/L、40 mU/L、200 mU/L、800 mU/L、2 000 mU/L。

1.2 方法

1.2.1標本采集 患者入院后清晨空腹時，靜脈取血4 ml，置真空采血管中，醫用低速離心機4 000 r/min 離心10 min，吸取血清檢測，其余分裝，保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2重組PAPP-A制備 利用DNAstar軟件分析PAPP-A的CDS區，選擇抗原性最強的抗原表位編碼區。以PAPP-A-質粒轉化菌種為模板制備DNA，PAPP-A的DNA和pET42a質粒分別雙酶切，凝膠回收、連接，轉化Top10大腸埃希菌，篩選陽性克隆鑒定正確后，轉化BL21大腸埃希菌，誘導產生PAPP-A重組蛋白，鎳柱純化PAPP-A重組蛋白。

1.2.3PAPP-A抗體制備、純化 利用制備的重組PAPP-A注射家兔，制備對應抗PAPP-A多克隆抗體。并用金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)親和層析法純化抗體。

1.2.4抗體標記微球 離心管中加入0.1 mg包被抗體，6 000 r/min離心10 min，用PBS緩沖液洗滌，重復3次，加入0.5 mg受體微球及1.5 μl Tween-20，加PBS 緩沖液至100 μl，37 ℃振蕩孵育48 h。

1.2.5生物素標記抗體 將抗PAPP-A抗體裝入MwCO為12 000的透析袋中，置0.1 mol/L的碳酸鹽溶液(pH 9.5)中充分透析，換液3次。將生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯(HOSU)溶于二甲基甲酰胺中，最終濃度20 mg/mL。將生物素與抗體混合，室溫下攪拌1 h?；旌弦涸?℃下用0.1 mol/L，pH 7.4的PBS溶液透析24 h。

1.2.6PAPP-A檢測 在96孔板中依次加入標準品及待測樣品25 μl、1∶100稀釋標有PAPP-A抗體微球30 μl、1∶2 000稀釋的生物素化抗體25 μl，37℃振動孵育30 min；避光加入100 μl鏈霉素親和素包被供體球，37℃振動孵育10 min，化學發光分析儀測定信號值。

1.2.7方法學評價 靈敏度、特異度、回收率、準確率、穩定性等方法學評價指標均按照實驗室成熟的方案進行。

1.2.8與時間分辨免疫熒光法(TRFIA)檢測對比 隨機挑選確診的陽性病例70例檢測。時間分辨免疫熒光法按試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1 重組抗原的純化及鑒定針對篩選的抗原決定簇集中表位，制備PAPP-A重組抗原，經過鎳柱純化后，進一步利用親和層析凝膠柱純化，1-4管PAPP-A活性較高，見圖1；經western blot鑒定有明顯目的條帶，見圖2。

圖1 重組PAPP-A蛋白經過免疫親和層析洗脫

圖2 重組PAPP-A蛋白經過western blot鑒定

2.2 標準曲線本研究建立的基于微球標記的化學發光檢測方法以參考標準品濃度為橫坐標，檢測信號值為縱坐標，由logistic曲線擬合(四參數)處理得到標準曲線，線性良好，見圖3。

圖3 PAPP-A標準曲線

2.3 方法學評價

2.3.1靈敏度 用標準曲線反算出0 mU/L OD值的±2s對應的濃度值，得出該方法的靈敏度為0.30 mU/L。

2.3.2準確度 回收實驗證明回收率在96%以上，說明此方法具有很好的準確性，見表1。

表1 不同濃度標本的回收率測定

2.3.3穩定性 穩定性實驗顯示，在37℃溫箱中放置3 d與0 d穩定性無明顯變化，5 d后標準品OD值均上升，但線性良好，說明試劑盒的穩定性良好。但放置7 d后，最大OD值較高，且線性變差，見圖4。

圖4 0、3、5、7天PAPP-A穩定性對比

2.4 方法測定結果的對比本文方法與精密度較高的時間分辨免疫熒光法[5]對比測定70例標本，以TRFIA試劑盒所測得PAPP-A濃度為X軸，本文方法測定PAPP-A濃度為Y軸，繪制散點圖，見圖5。變量進行相關性分析，r=0.982 (P<0.01)，說明兩種檢測方法相關性良好。

圖5 TRFIA試劑盒所測結果與本方法測定結果對比

2.5 各組血清PAPP-A水平比較IS各組PAPP-A 濃度較正常對照組升高，IS輕中重度組血漿PAPP-A 濃度比較差異均有統計學意義，P<0.01，見表2。

表2 IS輕中重度組、對照組PAPP-A 濃度比較

**P<0.01；a與對照組比較，b與輕度組比較，c與中度組比較，P<0.01

3 討論

IS發病迅猛、病死率高，其病程的主要變化是腦血管動脈粥樣硬化、易損斑塊的形成及破裂，基質金屬蛋白酶在動脈粥樣硬化斑塊的形成并發展為不穩定斑塊過程中起重要作用，早期檢測對降低易損斑塊、降低患病率、病死率有重要意義[6]。

PAPP-A屬于鋅離子依賴的基質金屬蛋白酶，于1974年在孕婦血清中發現。PAPP-A在孕婦血清中是四聚體形式存在，但是在血管疾病斑塊形成中存在形式是同二聚體，且含量極低。迄今為止，所發現的PAPP-A底物之一是胰島素樣生長因子結合蛋白4(IGF binding protein-4,IGFBP-4 )。有報道表明，抑制某些非編碼RNA如miR-490-3p可靶向作用于PAPP-A，促進水解IGFBP-4使IGF-1釋放[7,8]，IGF-1作用于血管平滑肌上的受體，促進炎性介質的釋放，促進平滑肌細胞的增殖遷移，間接促進動脈粥樣硬化的形成和發展[9]，表明PAPP-A是心血管系統動脈粥樣硬化斑塊形成的重要上游基因。另外，PAPP-A作為金屬蛋白酶之一，與多種信號通路相關，具有降解細胞外基質的作用，導致粥樣硬化斑塊破裂[10]。臨床診斷方面，2015年，Wang[4]等研究證實PAPP-A是IS患者良好的診斷指標。Wang[11]等研究發現PAPP-A 在IS患者表達顯著升高，PAPP-A可以作為預測IS患者臨床事件的預后指標。

目前臨床用于檢測患者血清PAPP-A含量方法仍主要基于ELISA，在方法學上抗原抗體反應的固有缺陷導致靈敏度不足。TRFIA靈敏度較高，本研究用來作為檢測對比標準。但TRFIA操作繁瑣，檢測昂貴，并非最優方法。本研究試圖建立一種增強檢測靈敏度及特異度的方法，增強PAPP-A臨床檢測的應用價值。首先，因為PAPP-A會與proMBP形成四聚體[12]，這種基于四聚體形式的抗原制備的抗體，使檢測有非特異反應，本研究挑選了PAPP-A的抗原優勢表位，制備了表位特異的抗體應用于后續的檢測，排除了proMBP抗原成分在其中引起的干擾。其次，由于PAPP-A含量低，ELISA檢測難以區分其余正常對照組的含量差別。本研究加樣后形成抗體包被發光顆粒-抗原-生物素化抗體的復合物，鏈霉素親和素包被的感光顆粒與之結合，適當的間距使感光顆粒在680 nm的激光照射下，促進周圍的氧分子激發，形成單線態氧，可引起發光顆粒發射熒光信號，單光子計數器可捕獲熒光信號，并根據信號值大小計算待測物的濃度。本研究利用化學發光法的高靈敏度，結合微球標記抗體增大反應面積以及生物素親和素的級聯放大效應可以有效檢測出PAPP-A信號值，在IS各組及正常對照組中差異有統計學意義。由此可見PAPP-A與IS患者疾病分層有密切關聯，可以作為高效準確的判定指標應用于臨床檢測IS患者[13]。

本研究建立的方法有效避免了其他表位及proMBP的非特異干擾，從根本上解決了非特異反應的問題，并且生物素親和素系統的參與以及受體微球及供體微球增大了反應面積，均使此反應體系有極高的靈敏度。本檢測方法操作簡單，適合于推廣。我們計劃后續擴大樣本量，深入研究IS發病初期及病情在進展中不同階段PAPP-A濃度的變化，以便早期明確診斷IS患者，并嚴密監控疾病進展及預后，使PAPP-A的臨床應用更廣泛。