CD16/CD13表達模式可以有效鑒別粒細胞相關疾病

王 卉，王愛先，甄軍毅，吳雪英，陳 曼，宮美維，宋雨竹，李 蘭

(1.河北燕達陸道培醫院 檢驗科，河北 廊坊065201；2.北京曠博生物技術股份有限公司，北京100176)

CD16是流式細胞術檢測發育階段粒細胞常用標志，因其編碼基因和抗體的復雜性，一些相關疾病呈現相似又不同的表型，需要加以區分。CD13表達強度隨著粒細胞分化成熟而變化，所以CD16/CD13是臨床監測粒細胞發育情況的常用抗體組合。本文介紹正常對照以及幾種容易誤診的粒細胞相關疾病的CD16及CD16/CD13表達模式，以研究其在鑒別不同疾病中的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑四色 FACSCalibur及八色FACSCanto流式細胞儀均購自美國Becton Dickinson(BD)公司。熒光標記嗜水氣單胞菌溶素(Fluorescein-labeled proaerolysin，FLAER)為加拿大CEDARLANE公司產品,其余單抗均為美國BD公司產品(其中CD16為BD Pharmingen產品)。

1.2 標本選擇2011年12月到2017年12月在北京市道培醫院和河北燕達陸道培醫院就診的病例。隨機選取正常對照50例；隨機選取骨髓增生異常綜合征(MDS)50例；全部夜間陣發性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)62例；全部粒細胞丟失CD16排除MDS和PNH后，疑診為Fcγ受體Ⅲ類B(FcγRⅢB)基因缺失患者11例(包括1例供者)。

1.3 抗體標記及流式細胞儀獲取按照陸道培醫院流式細胞室常規操作[1]。粒細胞發育階段的觀察使用CD16/CD13/CD45/CD11b抗體組合，單核細胞的評價使用CD14/CD64/CD45/CD11c組合。髓系原始細胞性質判斷使用CD34和(或)CD117設門，觀察CD7、CD56、CD19、HLA-DR、CD33、CD13、CD11b、CD15、CD96等標志是否存在異常表達。使用FLAER/CD64/CD45/CD14抗體組合以及紅細胞和粒細胞的CD55、CD59評價PNH克隆。

2 結果

50例正常對照，發育階段粒細胞CD16/CD13表達相似，均呈現“對勾”形狀。其他免疫表型有：髓系原始細胞無異常表達，紅細胞和粒細胞CD55、CD59，粒細胞和單核細胞CD55、CD59、FLAER均無明顯丟失。

50例MDS患者粒細胞CD16/CD13表達模式異常。主要表現為：CD16的表達多呈現不同程度的延續性；因為CD13和CD16抗原表達強度改變或者分布異常導致的粒細胞CD16/CD13發育模式異常。其他伴隨免疫表型有：常同時伴有粒細胞顆粒性減低、粒細胞CD11b/CD13發育模式異常等改變；髓系原始細胞可能會出現異常表達；原始細胞中CD19+B祖細胞占比減低；單核細胞異常表達；有核紅細胞比例升高、細胞變大、異常表達等。

62例PNH患者粒細胞CD16/CD13表達模式與正常對照不同，非常有特征性：CD16不同程度部分丟失；陰性和陽性細胞之間有明顯界限；陰性部分不是CD16完全丟失，而是呈現弱陽性。其他伴隨免疫表型有：同時出現粒細胞CD24、單核細胞CD14等GPI相關蛋白的丟失；紅細胞CD55、CD59，粒細胞和單核細胞CD55、CD59、FLAER的陰性細胞比例升高。

與其他粒細胞相關疾病不同，11例疑診為FcγRⅢB基因缺失患者粒細胞CD16完全丟失(見圖1)。除此之外無異常表達，CD55、CD59、FLAER表達無缺失。

3 討論

CD16抗原是人類FcγⅢ類受體(FcγRⅢ)，由位于1q22染色體上的FcγRⅢA和FcγRⅢB兩個基因編碼。前者主要表達于NK細胞和巨噬細胞，后者是一個糖基化磷脂酰肌醇(GPI)膜錨蛋白，只表達于粒細胞。所以FcγRⅢB基因缺失的患者、由于GPI蛋白缺陷導致的PNH病例，粒細胞CD16表達發生改變，而NK細胞的CD16表達不受影響[2]。

CD16的抗體復雜，文獻報道不同克隆的抗體針對不同位點：泛-FcγRⅢ CD16單克隆抗體主要包括：CLBFcRgranl (mIgG2a)、3G8 (mIgGl)、DJ13Oc (mIgGl)、BW209i2 (mIgG2a)；其他大多數克隆只針對部分位點，所以根據研究目的使用不同克隆抗體。臨床免疫分型檢測因為需要診斷和鑒別診斷各種疾病或者多態性，所以建議使用泛-FcγRⅢ CD16單克隆抗體。本文中使用的是3G8抗體。CD13熒光強度隨著粒細胞分化成熟發生改變，所以臨床常用CD16/CD13表達模式觀察粒細胞發育情況。

圖1 使用骨髓粒細胞CD16/CD13表達模式鑒別粒細胞相關疾病。顯示細胞群為發育階段粒細胞。a.健康對照。粒細胞CD16/CD13呈現對勾形狀。b.MDS病例。粒細胞CD16/CD13發育模式異常，CD16表達為延續性的分布異常。c.PNH病例。粒細胞CD16部分丟失，陰性和陽性之間有明顯界限，陰性部分呈現弱陽性表達。D.疑診FcγRⅢB基因缺失病例。粒細胞CD16完全丟失。

粒細胞CD16和CD16/CD13表達異常主要見于幾種情況：MDS[3]或者MDS/MPN、PNH[4]、FcγRⅢ B基因缺失[2]，此外有些感染、營養性貧血也可以出現粒細胞的CD16/CD13異常。但是只有FcγRⅢ B基因缺失是CD16完全丟失，其他疾病多少都會殘留一些CD16的表達。

MDS或者MDS/MPN的粒細胞CD16表達為延續性分布異常，導致CD16/CD13發育模式異常，同時伴有CD11b/CD13的發育模式異常。此外還會伴有粒細胞的其他異常表現，髓系原始細胞的異常、紅細胞和巨核異常、單核細胞異常、原始細胞中B祖細胞占比減低等，文獻[3]報道流式細胞術免疫分型診斷MDS的靈敏度為69%-98%，特異性78%-93%。結合臨床病史、骨髓形態學、染色體、基因突變等檢查會提供更多診斷信息。MDS是臨床上出現血細胞減少時首要想到的診斷之一，因此在經驗不足的情況下，出現粒細胞CD16/CD13表達模式異常時，也是容易誤診為該疾病。

PNH[4]克隆大小差別很大，因此粒細胞CD16/CD13的表達模式也會有不同。文章中的62例患者，CD16/CD13能看到的克隆大小1%-99%(中位數75%)。外周血因為均為表達CD16的成熟階段粒細胞，因此觀察靈敏度較高。骨髓因為存在CD16陰性的早幼粒和中晚幼粒階段細胞，所以少量的缺失容易被掩蓋，尤其是與MDS同時發生的時候。PNH的CD16丟失非常有特征性：不像MDS的延續性分布異常，而是陰性和陽性之間有明顯界限；陰性部分呈現弱表達，而非FcγRⅢB基因缺失那樣的完全陰性。有研究認為，CD16細胞表面FcγRⅢB比GPI分子大，可能存在GPI以外的結合位點和信號通道，導致PNH的CD16陰性部分呈現背景升高，非完全陰性。

與MDS、PNH相比，FcγRⅢB基因缺失發病率相對較高，但是因為絕大多數沒有明顯臨床表現，很多見于正常人，加上是除了流式細胞術以外，大多數其他檢測方法(尤其是第一道篩查項目形態學)無法發現的疾病，因此非常容易被臨床忽略。文獻報道粒細胞相關FcγRⅢB基因缺失在白人中發生率為0.1%，此外還有3%左右是雜合子[2]。在中國人中發病率尚無報道。因至少一系減少或者健康供者來陸道培醫院做免疫分型的患者中，排除其他影響因素后疑診為FcγRⅢB基因缺失的患者檢出率為0.2%。但是除了少數供者以外未包括大多數健康人，故數據統計缺乏人群代表性；而且研究只是排除其他疾病后推測，并未做相關基因檢測，所以可能造成推測的陽性率高于文獻報道[2]。但是也說明粒細胞相關的FcγRⅢB基因缺失或者說多態性的發生率可能并不低。雖然研究發現，FcγRⅢB基因缺失患者因為存在FcγRⅢA，所以大多數人并沒有嚴重感染，且最初是在健康獻血員和供者中發現[2]，故認為是一種可以忽略的正常人群多態性，但是在臨床診斷中，因為CD16的表達缺失會造成CD16/CD13表達模式異于正常，經驗不足的情況下容易誤診為MDS等其他粒細胞相關疾病，所以流式檢測醫師應該正確認識這種疾病。

總之，使用流式細胞術檢測髓系CD16/CD13表達，不同粒細胞相關疾病會呈現各自特征性表達模式。其中FcγRⅢB基因缺失雖然發病率高但卻是臨床容易忽略的問題，PNH也會造成CD16/CD13表達異常，經驗不足的時候這些疾病均容易誤診為MDS。而正確認識流式細胞術檢測粒細胞CD16/CD13免疫表型，可以簡單有效鑒別這些相關疾病。