黃葵膠囊對(duì)阿霉素腎病大鼠腎組織MCP-1表達(dá)及對(duì)腎組織病理?yè)p傷的影響

趙塔娜，蔡棟梁，苑露丹

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.兒二科；2.老年病科,黑龍江 佳木斯154001)

腎臟疾病的進(jìn)展過(guò)程由多種細(xì)胞炎性因子參與其中，最終進(jìn)展為終末期腎病(ESDR)。MCP-1在單核細(xì)胞趨化以及促腎臟纖維化過(guò)程中扮演著十分重要的角色[1]。近年來(lái)，黃葵及其提取物制劑被廣泛地應(yīng)用于各種類型的腎臟疾病之中，其臨床療效較為理想[2]。本研究主要采用基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的方法，探討了黃葵膠囊對(duì)AN大鼠腎組織MCP-1的表達(dá)情況及其對(duì)腎組織病理?yè)p傷產(chǎn)生的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇佳木斯大學(xué)動(dòng)物培養(yǎng)中心提供的30只清潔級(jí)雄性SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體重范圍為108 g-134 g，平均(119.78±10.98) g。使用標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，自由攝食、進(jìn)水。

1.2 藥物及試劑阿霉素(ADR)：海正輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H33021980號(hào)；黃葵膠囊：江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z19990040號(hào)；MCP-1抗體、二抗均購(gòu)自于上海鈺博生物科技有限公司；免疫組化染色試劑盒購(gòu)自于上海聯(lián)邁生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物建模 首先取健康SD雄性大鼠于尾靜脈一次性注入6.5 mg/kg的鹽酸阿霉素，于第7 d及第14 d置于代謝籠中，留24 h尿液，并注意對(duì)小鼠尿蛋白進(jìn)行測(cè)定分析。如果24 h尿蛋白定量在100 mg以上，則表明動(dòng)物造模已成功。

1.3.2動(dòng)物分組及藥物干預(yù) 正常組大鼠10只，剩余的20只為建模大鼠。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為模型對(duì)照組(n=10)及治療組(n=10)。黃葵治療方法為：每次給藥1粒，溶化成藥液，3次/d，給藥劑量為2.0 g/(kg·d)，給藥方式為灌胃，1個(gè)療程為8周，正常組與模型對(duì)照組均給予與黃葵等量的生理鹽水灌胃，同樣為8周。根據(jù)體表面積公式：A=K×W2/3，對(duì)大鼠每天所需要的藥物劑量進(jìn)行計(jì)算。

1.4 檢測(cè)項(xiàng)目及方法

1.4.124 h尿蛋白 在灌注藥物及生理鹽水后第2周及第8周時(shí)，放置代謝籠，并留取24 h尿液，使用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)24 h尿蛋白定量指標(biāo)水平進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.4.2血生化指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)第2周及第8周時(shí)，每組均分別采取斷椎法處死大鼠，于股動(dòng)脈取血，經(jīng)離心后取上清液，使用貝克曼庫(kù)爾特AU5800型全自動(dòng)生化分析儀對(duì)血肌酐(Scr)及血白蛋白(Alb)水平進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.4.3腎組織形態(tài) 將處死過(guò)的大鼠腎臟皮質(zhì)溶于濃度為10%的福爾馬林溶液中進(jìn)行固定，使用石蠟包埋之后，再行HE染色，然后于光鏡下對(duì)腎組織病理改變情況進(jìn)行觀察。

1.4.4SP法檢測(cè)腎組織MCP-1蛋白的表達(dá)情況 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。在圖像采集分析系統(tǒng)下，于每張切片上隨機(jī)采集5個(gè)不重疊的視野，棕黃色部分則表示為MCP-1陽(yáng)性表達(dá)。采用Image圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，對(duì)每個(gè)視野中的腎間質(zhì)陽(yáng)性染色總面積進(jìn)行測(cè)量，取均值。MCP-1在腎組織陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)=陽(yáng)性信號(hào)面積/視野面積。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況各組大鼠在建模之前反應(yīng)比較靈敏，毛發(fā)光滑度佳。大鼠建模3 d之后，大鼠發(fā)生精神萎靡、活動(dòng)減少等方面的情況，部分大鼠發(fā)生體毛稀疏、反應(yīng)遲鈍等情況，上述癥狀在模型對(duì)照組中表現(xiàn)更為顯著，黃葵治療組整體情況要比模型對(duì)照組好。

2.2 各組24 h尿蛋白定量變化情況對(duì)比第2周、第8周模型對(duì)照組與治療組24 h尿蛋白定量水平均高于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的正常大鼠24 h尿蛋白定量水平(P均<0.05)，且治療組第2周、第8周時(shí)24 h尿蛋白定量水平均分別顯著小于模型對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)的24 h尿蛋白定量水平(P均<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組24 h尿蛋白定量變化情況比較

注：與正常對(duì)照組比較，①P<0.05；與模型對(duì)照組比較，②P<0.05.

2.3 各組大鼠血生化指標(biāo)水平對(duì)比第2周、第8周模型對(duì)照組與治療組血Scr水平均高于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的正常對(duì)照組大鼠血Scr水平(P均<0.05)，且治療組第2周、第8周時(shí)血Scr水平均分別顯著小于模型對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)的血Scr水平(P均<0.05)；第2周、第8周模型對(duì)照組與治療組血Alb水平均低于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的正常對(duì)照組大鼠血Alb水平(P均<0.05)，且治療組第2周、第8周時(shí)血Alb水平均分別顯著高于模型對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)的血Alb水平(P均<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠生化指標(biāo)水平比較

注：與正常對(duì)照組比較，①P<0.05；與模型對(duì)照組比較，②P<0.05.

2.4 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)腎組織光鏡檢查結(jié)果對(duì)比光鏡HE染色結(jié)果：經(jīng)光鏡檢查，正常對(duì)照組大鼠腎小球、腎間質(zhì)、腎小管等均正常。第2周末時(shí)，模型對(duì)照組少數(shù)大鼠腎小球存在基質(zhì)與系膜細(xì)胞輕度增生，有少量腎小球包氏囊厚度增大，球囊發(fā)生粘連現(xiàn)象，少量腎小管出現(xiàn)擴(kuò)張，剩下大鼠的腎組織無(wú)顯著異?，F(xiàn)象(見(jiàn)下圖1所示)；第8周末時(shí)，模型組大鼠腎小球存在局灶節(jié)段硬化的現(xiàn)象，出現(xiàn)包氏囊厚度增加以及球囊出現(xiàn)粘連，某些腎小管出現(xiàn)萎縮，部分腎間質(zhì)出現(xiàn)纖維化現(xiàn)象，且在光鏡下可探查局灶性炎癥細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)反應(yīng)。在同一時(shí)間節(jié)點(diǎn)，治療組大鼠腎臟病變較模型組大鼠要更加輕微(見(jiàn)下圖2所示)。

圖1 實(shí)驗(yàn)2周末時(shí)各組腎組織切片光鏡HE染色(×40)

圖2 實(shí)驗(yàn)8周末時(shí)各組腎組織切片光鏡HE染色(×40)

2.5 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)腎組織MCP-1陽(yáng)性表達(dá)情況對(duì)比第2周、第8周模型對(duì)照組與治療組MCP-1在腎組織陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)均高于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的正常對(duì)照組大鼠MCP-1在腎組織陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)(P均<0.05)，且治療組第2周、第8周時(shí)MCP-1在腎組織陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)均分別顯著小于模型對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)的MCP-1在腎組織陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)(P均<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)腎組織MCP-1陽(yáng)性表達(dá)情況比較

注：與正常對(duì)照組比較，①P<0.05；與模型對(duì)照組比較，②P<0.05.

3 討論

阿霉素腎病模型與人類微小病變型腎病相類似，該模型主要采取雄性大鼠或者SD大鼠尾靜脈單次注射5-7.5 mg/kg的阿霉素，在ADR注射入大鼠體內(nèi)4-5 d之后出現(xiàn)尿蛋白現(xiàn)象，14 d后尿蛋白水平會(huì)出現(xiàn)峰值，然后發(fā)生典型性的腎病表現(xiàn)，伴隨浮腫、高脂血癥、低蛋白血癥等并發(fā)癥，上述癥狀持續(xù)時(shí)間一般在半年以上。本研究所采用的大鼠，平均體重(119.78±10.98)g，尾靜脈注射ADR劑量為6.5 mg/kg。與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠表現(xiàn)精神狀況較萎靡，出現(xiàn)短時(shí)間腹瀉癥狀，納差，體重顯著下降。模型對(duì)照組大鼠在尾靜脈注射ADR后一周，尿蛋白水平顯著升高，到第2周時(shí)，模型組(模型對(duì)照組、治療組)大鼠24 h尿蛋白定量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)100 mg，且模型組24 h尿蛋白定量顯著高于正常對(duì)照組(P均<0.05)，此結(jié)果提示：本研究大鼠造模非常成功。

MCP-1的表達(dá)主要受核轉(zhuǎn)錄因子-β(NF-β)與轉(zhuǎn)錄活化蛋白1(TAP-1)之間的協(xié)調(diào)作用所決定的。曹陽(yáng)等[3]通過(guò)綜述的方法，闡述了MCP-1與腎病綜合征之間的關(guān)系。所以，將腎組織中的MCP-1的過(guò)度表達(dá)進(jìn)行抑制，能夠有效降低單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞同血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附作用，對(duì)單核細(xì)胞趨化以及激活單核細(xì)胞釋放出的各種細(xì)胞因子進(jìn)行抑制，從而使得腎臟損傷程度得以顯著減小，蛋白尿水平顯著下降[4]。

現(xiàn)代藥理研究證實(shí)：黃葵中包括槲皮素、楊梅黃素等在內(nèi)的5種黃酮類化合物單體，具有抗腎小球免疫炎性反應(yīng)、降低尿蛋白水平以及抗血小板聚集、保護(hù)腎臟功能等方面的效果[5-10]。本研究結(jié)果提示：黃葵膠囊能夠有效降低ADR腎病大鼠24 h尿蛋白量、血Scr水平及MCP-1陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)，提高血Alb水平。此外，本研究結(jié)果還顯示：黃葵還能夠有效保護(hù)ADR腎病大鼠的腎臟組織。陳洪宇等[11]探討了中藥防己黃芪湯加減治療阿霉素腎病大鼠的療效及其對(duì)大鼠腎組織MCP-1的影響，經(jīng)腎組織切片光鏡HE染色，結(jié)果顯示：治療組治療8周后腎組織未見(jiàn)明顯異常狀況，且治療組治療8周后腎組織MCP-1表達(dá)的陽(yáng)性指數(shù)均較模型對(duì)照組顯著下降(P均<0.05)，本研究結(jié)果與其相類似。

綜上所述，黃葵膠囊能夠降低ADR腎病大鼠24 h尿蛋白量、血Scr及MCP-1陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)及提高血Alb水平，改善大鼠腎組織功能。