Res對吸煙致COPD模型大鼠肺泡巨噬細胞分泌相關因子和表面標記物的影響研究

李 珠，孫武裝，閆曉婧

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)是臨床常見的慢性進展性呼吸系統病癥，以持續氣流受限為主要病理表現[1]。臨床普遍認為，COPD發病與吸煙、職業性粉塵、化學物質、空氣污染等有關[2]。近年來，COPD的發病率、病死率呈上升趨勢[3]。肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage， AM)是一種廣泛存在于肺泡內和支氣管表層的炎性細胞，在抗菌、免疫調節、炎性反應等方面起著重要作用，而AM過度釋放白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)及基質金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)等細胞因子是COPD肺組織損傷的關鍵[4]。當前治療COPD主要為對癥治療或緩解氣道炎癥治療，但二者均不能有效改變肺功能漸進性下降和氣道炎癥。近年抗細胞因子治療取得了較好效果。白藜蘆醇(Res)是一種主要存在于葡萄等水果中的多酚類化合物[5-7]。研究證實，Res有著良好的抗炎、抗菌、抗氧化及抑制細胞因子等作用[8-9]。巨噬細胞可分為M1型和M2型，M1型巨噬細胞可產生促炎細胞因子，M2型巨噬細胞可增強細胞因子的分泌，二者在COPD中的作用機制是目前臨床研究的重點。本文主要通過對比分析不同劑量Res干預對吸煙致COPD模型大鼠AM中IL-6、TNF-α、MMP-9、TIMP-1及相關表面標記物的影響，探討相關細胞因子及表面標記物在COPD中的作用機制，以更好地指導臨床治療。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 75只SD新生大鼠及飼料購于河北醫科大學實驗動物中心,實驗動物許可證號：SCXK2018-0019；雌38只，雄37只；生長齡5.1～6.3(5.2±0.3)個月；體質量250.8～260.4(254.3±5.6)g。SD大鼠由專人飼料喂養，相同喂養方法(自由飲食)，飼料和用水新鮮無污染。

1.2 研究方法

1.2.1 分組：采用隨機數字表法將所有SD新生大鼠分為研究A組、研究B組、研究C組及研究D組和對照組，每組各15只。研究A組：雌8只，雄7只；生長齡5.6～5.8(5.7±0.2)個月；體質量255.9～258.0(256.7±20.3)g。研究B組：雌8只，雄7只；生長齡5.0～5.9(5.5±0.6)個月；體質量256.3～259.8(256.2±31.2)g。研究C組：雌7只，雄8只；生長齡5.4～5.8(5.6±0.5)個月；體質量255.3～257.5(256.2±26.7)g。研究D組：雌8只，雄7只；生長齡5.5～6.0(5.7±0.3)個月；體質量256.0～258.2(257.2±18.4)g。對照組：雌7只，雄8只；生長齡5.3～5.9(5.5±0.1)個月；體質量252.7～256.1(255.0±33.8)g。5組SD新生大鼠在雌雄比例、生長齡及體質量等方面比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本實驗通過動物保護和使用委員會審查并獲得批準開展。

1.2.2 造模：5組SD新生大鼠均進行2周的適應性飼養后，通過點燃香煙吸入煙霧的方式制作COPD模型。具體操作：備好1個規格為100 cm×80 cm×80 cm的密閉式熏箱，在每個側壁留制1個2.5 cm×2.5 cm的窗孔，然后把選取的大鼠放入箱內；采用被動吸煙法：箱內每次同時點燃4支香煙(江西中煙生產的金圣牌軟包裝香煙，焦油含量11 mg，煙堿量1.0 mg，煙氣一氧化碳量12 mg)，當香煙燃燒完畢、煙霧消失后，開啟箱蓋5 min后繼續點燃4支香煙，循環進行，點燃12支香煙后去除大鼠，清洗煙箱。每日2次，每次間隔6 h以上，持續6個月。6個月后手術取大鼠右肺上葉組織條，經40 g/L多聚甲醛固定過夜，常規石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察病理切片發現支氣管纖毛呈倒伏，且杯狀細胞增生，分泌物增加，支氣管管壁下炎性細胞明顯增多，肺泡腔明顯擴大，肺泡壁斷裂，肺泡融合，見顯著肺氣腫，同時肺泡間隔水腫增寬，成纖維細胞增生，小氣道平滑肌增殖紊亂，血管腔狹窄，即為COPD造模成功。5組大鼠均造模成功。

1.2.3 純化AM：各組均行AM純化。

1.2.3.1 肺泡灌洗液采集：使用95.0%乙醇浸泡3～5 min處死大鼠，剪開頸部皮膚，妥善分離氣管，再用絲線于環狀軟骨下妥善結扎。應用7號小兒頭皮針置入氣管內，用絲線固定。2 ml注射器抽RPMI 1640培養液1.2 ml，緩慢推入氣管(最好先回抽肺殘留氣體)，停留1 min后逐步回抽，得回收液約1 ml。將回收液注入帶塞離心管內。上述操作重復10次。將取得的液體在2000 r/min條件下離心10 min后棄去上清液，制成單細胞懸液，細胞濃度調控在1.5×106/ml。

1.2.3.2 AM純化：把上述得到的單細胞懸液2 ml、瓊脂培養液7 ml及大鼠血清1 ml加入到25 ml的培養瓶中，充分混勻后放入37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱內持續孵育2.5 h，使AM貼壁。將非貼壁細胞去除后，加乙二胺四乙酸二鈉10 ml。30 min后回收貼壁細胞，2000 r/min離心10 min，應用培養液洗滌3次，將細胞濃度調控在1.5×106/ml，即獲得純化后的AM液。

1.2.4 Res預處理

1.2.4.1 研究組：取研究A組、B組、C組及研究D組AM純化液，用傳代3次的AM細胞接種于96孔板內，穩定3 d，分別加入50、100、150、200 mol/L Res(杭州瑞樹生化有限公司生產)預處理12 h。

1.2.4.2 對照組：取對照組AM純化液，用傳代3次的AM細胞接種于96孔板內，穩定3 d，不行Res預處理。

1.3 主要儀器設備 Trizol RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒(美國Invitro-den公司生產)；NF-κB基因引物(上海生物工程公司合成)；聚合酶鏈式反應(PCR)檢測儀(美國Bio-Rad公司生產)；ChemiDoc XRS凝膠圖像分析系統(美國Bio-Rad公司生產)；MR Ⅲ型酶標儀(美國Hyperion公司生產)。

1.4 觀察指標 對比觀察5組SD大鼠Res不同時間(4、6、12 h)干預下細胞因子(IL-6、TNF-α、MMP-9、TIMP-1)和M1型巨噬細胞的表面標記物CD11c、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、M2型巨噬細胞表面標記物精氨酸酶1(Arg-1)、CD206)表達的水平。

1.4.1 IL-6、TNF-α、MMP-9及TIMP-1測定：于Res干預4、6、12 h時提取5組96孔板內的待測AM純化液，采用酶聯免疫吸附法檢測5組大鼠IL-6、TNF-α、MMP-9及TIMP-1水平。試劑盒購自美國R&D公司，采用Hyperion MR Ⅲ型酶標儀測定。

1.4.2 巨噬細胞表面標記物測定：于Res干預4、6、12 h時提取96孔板內的待測AM純化液，用Trizol法提取AM貼壁細胞總RNA，以總RNA為模板將總RNA反轉錄合成cDNA，設計基因引物，用Real-time PCR SYB Green行熒光定量PCR檢查檢測基因表達水平，以β-actin作為內參照，基因表達相對倍數變化用2-ΔΔCt計算。

2 結果

2.1 5組大鼠不同Res干預時間AM中IL-6水平比較 干預4、6 h時各組大鼠AM中IL-6含量比較差異均無統計學意義(P>0.05)，干預12 h時隨著Res干預劑量的增大AM中IL-6含量隨之降低，差異有統計學意義(P<0.01)。隨著Res干預時間的延長5組大鼠AM中IL-6含量均升高，而且在干預12 h時達峰值，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 SD大鼠慢性阻塞性肺疾病5組不同劑量白藜蘆醇不同干預時間肺泡巨噬細胞中白細胞介素6水平比較

注：研究A、B、C、D組分別為予白藜蘆醇50、100、150、200 mol/L干預的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組，對照組為未予白藜蘆醇干預的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組；與同組干預4 h比較，aP<0.05，bP<0.01;與同組干預6 h比較，cP<0.05

2.2 5組大鼠不同Res干預時間AM中TNF-α水平比較 相同干預時間，AM中TNF-α水平對照組>研究A組>研究B組>研究C組>研究D組，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。對照組及研究A組、B組、C組、D組AM中TNF-α水平在干預4 h后逐步升高，到6 h時達峰值，隨后下降，干預12 h時除研究B、C、D組下降至干預4 h時水平，余組內不同時間點兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 5組SD慢性阻塞性肺疾病大鼠不同劑量白藜蘆醇不同干預時間肺泡巨噬細胞中腫瘤壞死因子α水平比較

注：研究A、B、C、D組分別為給予白藜蘆醇50、100、150、200 mol/L干預的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組，對照組為未給予白藜蘆醇干預的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組；與同組干預4 h比較，aP<0.05；與同組干預6 h比較，cP<0.05

2.3 5組大鼠不同Res干預時間AM中MMP-9比較 相同干預時間，AM中MMP-9水平對照組<研究A組<研究B組<研究C組<研究D組，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。對照組及研究A組、B組、C組、D組AM中MMP-9在干預4 h后逐步升高，到6 h時達峰值，隨后下降，組內不同時間點兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 5組SD慢性阻塞性肺疾病大鼠不同劑量白藜蘆醇不同干預時間肺泡巨噬細胞中基質金屬蛋白酶9比較

注：研究A、B、C、D組分別為予白藜蘆醇50、100、150、200 mol/L干預的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組，對照組為未予白藜蘆醇干預的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組；與同組干預4 h比較，aP<0.05，bP<0.01；與同組干預6 h比較，cP<0.05

2.4 5組大鼠不同Res干預時間AM中TIMP-1水平比較 相同干預時間，研究A組、B組、C組、D組均高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，但研究A組、B組、C組、D組間AM中TIMP-1水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；對照組及研究A組、B組、C組、D組AM中TIMP-1水平在干預4 h后逐步升高，干預6 h時達峰值，隨后下降，組內不同時間點兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 5組SD慢性阻塞性肺疾病大鼠不同劑量白藜蘆醇不同干預時間肺泡巨噬細胞中基質金屬蛋白酶抑制劑1水平比較

注：研究A、B、C、D組分別為予白藜蘆醇50、100、150、200 mol/L干預的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組，對照組為未予白藜蘆醇干預的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組；與同組干預4 h比較，aP<0.05，bP<0.01;與同組干預6 h比較，cP<0.05

2.5 5組大鼠不同Res干預時間巨噬細胞表面標記物水平比較 相同干預時間，隨著Res干預劑量的增加，CD11c、iNOS表達明顯減弱，Arg-1、CD206表達明顯增強，差異均有統計學意義(P<0.05)；且同組內隨著Res干預時間的延長CD11c、iNOS表達逐漸減弱，Arg-1、CD206表達逐漸增強，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5。

3 討論

吸煙是COPD一個主要的致病因素，在長期吸煙過程中，煙霧所含的有害顆粒、氧化物質會對支氣管黏膜纖毛系統造成直接性損傷，引發支氣管痙攣，進而導致呼吸道防御、自凈等功能減弱。煙霧刺激還會誘導活化中性粒細胞、巨噬細胞及嗜酸粒細胞釋放多種蛋白酶，而且會抑制抗蛋白酶類物質的生成，如此導致蛋白酶/抗蛋白酶失衡，同時還會釋放大量的氧自由基、氧化產物破壞與降解大量細胞外基質，致使彈性纖維斷裂，進而造成肺組織逐步破壞而形成肺氣腫。此種炎性細胞與炎性因子網絡在煙霧的誘發下會產生相互作用，加快肺組織破壞及氣道重塑，進而讓氣流阻塞呈進展性變化，最終發展成COPD。

表5 5組SD慢性阻塞性肺疾病大鼠不同劑量白藜蘆醇不同干預時間肺泡巨噬細胞表面標記物水平比較

注：研究A、B、C、D組分別為給予白藜蘆醇50、100、150、200 mol/L干預的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組，對照組為未給予白藜蘆醇干預的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組；與同組干預4 h比較，aP<0.05;與同組干預6 h比較，cP<0.05

炎性反應是COPD主要病理改變，中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞參與其的發生、發展。近年研究表明，AM活化可能是COPD發生、發展的重要途徑[10]。AM活化后會產生TNF-α、MMP-9等多種活性介質，引起炎性細胞聚集，并浸潤肺臟導致肺損傷。氧化/抗氧化失衡已被證實是COPD肺損傷的主要病理機制，提示氧化應激和COPD的發生、發展有著密切的關系。抗氧化劑能有效改善患者的肺功能，且可延緩肺功能損傷，提升患者生活質量[11]。

研究發現，Res對COPD大鼠有著良好的抗氧化作用，這可能和降低有絲分裂原活化蛋白激酶家族中的應激蛋白p38、ERK及JNK磷酸化水平，進而抑制炎性蛋白酶釋放有關[12]。具體而言，就是Res通過降低機體促炎因子水平、提升內源性巰醇抗氧化物水平，進而對COPD模型大鼠的肺組織產生良好的抗氧化、抗炎作用。還有研究證實，Res可有效抑制COPD大鼠氧分壓的降低，提升用力呼氣量/用力肺活量比值，減少肺泡灌洗液中細胞間黏附分子21含量，降低肺濕/干重比，進而減輕肺組織損傷[13]。此外，還有研究發現Res對COPD患者外周血單核細胞DNA氧化損傷有著良好的體外修復作用，且對肺損傷有良好的保護作用[12]。

TNF-α是一種內源性細胞因子，可激活中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等促炎因子釋放。臨床研究表明，TNF-α可通過本身致炎作用和活化其他炎性細胞因子基因轉錄導致氣道炎性反應[14]。IL-6是誘導急性期炎性反應，其可通過激活蛋白水解促進肌肉分解代謝。同時，IL-6可活化NF-κB抑制肌纖維蛋白合成，導致COPD患者分解代謝增強，合成代謝減弱，進而造成患者惡病質。MMP-9是基質金屬蛋白酶家族(matrix metallo proteinases, MMPs)重要成員，MMPs可促進炎性細胞浸潤，致細胞外基質分解，破壞血管內皮、氣道上皮基底膜，使炎性細胞游出并聚集于靶細胞[15]。而TIMP-1是MMP-9重要的天然抑制劑，可特異性抑制MMP-9活性，促進成纖維細胞增生和膠原合成，致膠原細胞于肺泡壁過度沉積。當前研究表明，TIMP-1可反映氣道組織修復情況，是氣道重塑的一個重要標志物[16]。MMP-9與TIMP-1保持一定的動態平衡，以便維持細胞外基質的合成和降解平衡，而該機制一旦被打破則會導致細胞外基質代謝紊亂，膠原沉積、氣道重塑形成[17]。本結果顯示：隨著Res干預時間的延長5組大鼠AM中IL-6含量均升高，且在干預12 h時達峰值，干預12 h時隨著干預劑量的增大AM中IL-6含量隨之降低；相同干預時間，AM中TNF-α水平對照組>研究A組>研究B組>研究C組>研究D組，MMP-9水平對照組<研究A組<研究B組<研究C組<研究D組，研究A組、B組、C組、D組AM中TIMP-1水平均高于對照組；對照組及研究A組、B組、C組、D組AM中TNF-α、MMP-9、TIMP-1水平在干預后4 h后逐步升高，6 h時達峰值，隨后下降。可以認為有效劑量的Res能控制上述細胞因子分泌，與相關報道結果基本一致[18]。由此表明，Res對吸煙致COPD模型大鼠AM中IL-6、TNF-α、MMP-9、TIMP-1有著積極的影響。

巨噬細胞可分為經典激活、發揮促炎作用的M1型和替代活化、發揮抗炎作用的M2型。M1型巨噬細胞可產生促炎細胞因子，被稱為經典型巨噬細胞，具有很強的殺死微生物特性，但這種特性容易引起組織破壞。M2型巨噬細胞可增強白細胞介素1β、TNF-α、白細胞介素12和白細胞介素18等細胞因子的分泌。本結果顯示，相同干預時間，隨著Res干預劑量的增加，CD11c、iNOS表達明顯減弱，Arg-1、CD206表達明顯增強；且同組內隨著Res干預時間的延長CD11c、iNOS表達逐漸減弱，Arg-1、CD206表達逐漸增強。提示Res的應用有助于改善COPD模型大鼠病情。

綜上所述，Res對吸煙致COPD模型大鼠AM中IL-6、TNF-α有良好的抑制作用，并可促進MMP-9、TIMP-1分泌，明顯減弱M1型巨噬細胞表面標記物的表達，加強M2型巨噬細胞表面標記物的表達，有助于改善模型大鼠病情。