針藥結合對腦卒中肢體痙攣大鼠腦組織海馬γ-氨基丁酸a型受體和腦源性神經營養因子表達的影響

黃麟荇　王彭漢　郭斌　謝志強　謝莉娜　劉未艾　易麗貞　劉欣　岳增輝

摘要：目的 ?觀察針藥結合對腦卒中肢體痙攣大鼠腦組織海馬γ-氨基丁酸a型受體（GABAa）和腦源性神經營養因子（BDNF）表達的影響，探究針藥結合治療腦卒中后肢體痙攣的作用機制。方法 ?采用中動脈線栓結合內囊注射NMDA受體制作腦卒中肢體痙攣大鼠模型。45只實驗大鼠隨機分為模型組、針藥結合組（針刺陽陵泉、曲池+加味芍藥甘草湯水煎劑灌胃）、西藥組（巴氯芬溶液灌胃）、空白組（不做任何處理）和假手術組（干預同模型組，只分離不結扎不插線）。各治療組大鼠成模后第1日開始干預，連續5 d。采用RT-PCR和Western blot分別檢測大鼠腦組織海馬BDNF、GABAa mRNA和蛋白的表達。結果? 與空白組比較，假手術組大鼠神經功能、肌張力評分差異無統計學意義（P>0.05），模型組大鼠神經功能和肌張力評分明顯增加（P<0.01）;與模型組比較，西藥組和針藥結合組大鼠神經功能、肌張力評分明顯降低（P<0.05），BDNF、GABAa mRNA和蛋白表達均顯著升高（P<0.01）;與西藥組比較，針藥結合組變化不明顯（P>0.05）。結論 ?針藥結合可改善模型大鼠神經功能，保護神經損傷，緩解卒中后肢體痙攣，其機制可能與上調模型大鼠腦組織海馬中GABAa、BDNF mRNA和蛋白的表達相關。

關鍵詞：針藥結合;腦卒中肢體痙攣;腦源性神經營養因子;γ-氨基丁酸a型受體;大鼠

中圖分類號：R245;285.5 ???文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2020）01-0045-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201905020

Effects of Acupuncture Combined with Medicine on Expressions of γ-aminobutyric Acid Type a Receptor and Brain-derived Neurotrophic Factor in Hippocampus of Rats withLimb Spasm Caused by Cerebral Stroke

HUANG Linxing¹， WANG Penghan¹， GUO Bin¹， XIE Zhiqiang¹， XIE Lina¹， LIU Weiai²，YI Lizhen¹， LIU Xin¹， YUE Zenghui¹

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China;2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410005， China

Abstract： Objective To analyze the effects of acupuncture combined with medicine on the expressions of γ-aminobutyric acid type a receptor （GABAa） and brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in hippocampus of rats with limb spasm caused by cerebral stroke; To explore the mechanism of acupuncture combined with medicine for limb spasm caused by cerebral stroke. Methods A rat model with limb spasm caused by cerebral stroke was made by injecting NMDA receptor into the middle capsule with a middle artery suture. Totally 45 SD rats were randomly divided into model group， acupuncture-medicine combination group （acupuncture on Yanglingquan and Quchi + modified Shaoyao Gancao Decoction for gavage）， Western medicine group （baclofen solution for gavage）， blank group （without any intervention） and sham-operation group （the same intervention as the model group， only being separated without ligation without plugging）. Each administration group was intervened on the first day after the successful establishment of the model， and continued for 5 days. The expressions of BDNF， GABAa mRNA and protein in hippocampus of rats were detected by Western blot and RT-PCR， respectively. Results Compared with the

blank group， there was no statistical significance in nerve function and muscle tension in the sham-operation group （P>0.05）， but the scores of nerve function and muscle tension in the model group increased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， the scores of nerve function and muscle tension in the Western medicine group and acupuncture-medicine combination group decreased significantly （P<0.05）， but the expressions of BDNF， GABAa mRNA and protein increased significantly （P<0.01）. Compared with the Western medicine group， the changes of the acupuncture-medicine combination group were not obvious （P>0.05）. Conclusion Acupuncture combined with medicine can improve neurological function in rats， protect nerve injury and relieve limb spasm caused by cerebral stroke. The mechanism may be related to the up-regulation of expressions of GABAa and BDNF mRNA and protein in hippocampus of model rats.

Keywords： acupuncture-medicine combination; limb spasm caused by cerebral stroke; brain-derived neurotrophic factor; γ-aminobutyric acid type a receptor; rats

腦卒中因其有發病率、死亡率、致殘率、復發率高的特點，已成為嚴重危害人類健康的疾病^[1]。隨著醫療水平的提高，其病死率明顯下降，但致殘率仍居高不下^[2]。相關資料顯示，約4/5腦卒中偏癱患者會出現不同程度肢體痙攣^[3]，嚴重影響肢體運動功能的恢復。針藥結合療法是臨床治療腦卒中后肢體痙攣狀態的有效手段。研究表明，針藥結合能有效降低肌張力、改善肢體運動功能、提高日常活動能力^[4-6]。課題組前期臨床研究顯示，經筋刺法結合加味芍藥甘草湯能更好地緩解腦卒中后偏癱患者的肌肢體痙攣^[7]。現代醫學認為，抑制性神經遞質γ-氨基丁酸（GABA）影響卒中后痙攣的形成和加強，是中樞神經系統中最重要的抑制性物質^[8]，其與γ-氨基丁酸a型受體（GABAa）在突觸后膜相結合，抑制過度神經元放電，從而防止痙攣的發生^[9]。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）作為神經系統發育過程中的關鍵信號分子，在中樞神經系統廣泛分布，是在腦內合成的一種小分子堿性蛋白，對神經系統發育非常重要。其參與GABA能神經元可塑性的調節，對GABA能神經元的可塑性起著關鍵作用^[10]。因此，本實驗觀察電針結合加味芍藥湯對腦卒中后肢體痙攣大鼠海馬區GABAa和BDNF表達的影響，探究其緩解肢體痙攣狀態的可能作用機制，為臨床治療提供依據。

1? 材料與方法

1.1? 動物及分組

SPF級雄性SD大鼠45只，體質量（240±30）g，湖南中醫藥實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK（湘）2016-0002，動物質量合格證號43004700044333。飼養于湖南中醫藥大學動物實驗室中心清潔級動物實驗房，室溫20～25 ℃，相對濕度50%～70%，通風良好，普通飼料喂養。動物適應性喂養1周后編號，將45只大鼠按隨機數字表分為空白組、假手術組、模型組、西藥組和針藥結合組，每組9只。

1.2? 藥物

加味芍藥甘草湯（白芍30 g，甘草10 g，炙黃芪 30 g，當歸15 g，川芎15 g，地龍10 g，雞血藤15 g，木瓜10 g，桑枝30 g，伸筋草10 g，山萸肉10 g，枸杞子10 g），飲片購自湖南中醫藥大學第二附屬醫院中藥房，按比例配方取藥，蒸餾水浸泡1 h，繼以武火急煎至沸騰，再以文火煎煮2 h，取汁后以紗布過濾，藥渣再加蒸餾水文火煎煮1 h，過濾取汁。合并2次藥汁，濃縮至含原藥材10 g/mL，置于4 ℃冰箱保存備用。巴氯芬片，福安藥業集團寧波天衡制藥有限公司，批號180503C01，10 mg/片，研成細粉末，溶于蒸餾水，配制成0.27 mg/mL溶液備用。

1.3? 主要試劑與儀器

NMDA受體（武漢華聯科生物技術有限公司），Rabbit bs-1232R GABA A Receptor alpha 1（Bioss），Rabbit ab108319 BDNF（Abcam）。大鼠腦立體定位儀（日本成茂公司，SN-2），牙科鉆（南京金恒川電子有限公司，MF4G），離心機（德國Eppendorf，Centrifuge5424R），LRH-150 37 ℃恒溫培養箱（上海一恒），電泳儀（BIO-RAD，miniprotean3cell），酶標儀（芬蘭雷勃，MK3），微量移液槍（美國RaininPiPet-Lite），JY045-3C凝膠成像系統（北京君意），電針儀（蘇州醫療用品廠有限公司，SDZ-V），華佗牌0.3 mm×13 mm一次性針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司）。

1.4? 造模

采用改良中動脈線栓法結合內囊注射NMDA受體制作腦卒中肢體痙攣大鼠模型^[11]。腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，備皮、消毒、鋪巾、鈍性分離，結扎頸外動脈（ECA）近心端、頸總動脈（CCA）遠心端，動脈夾夾閉頸內動脈（ICA），插線，完畢后將ICA近心端和栓線一起結扎，縫合切口。將Zea Longa評分^[12]1～3分大鼠第2日再行內囊注射NMDA受體^[13]。將麻醉成功大鼠固定于腦立體定位儀上，行常規備皮、消毒、鋪巾，沿顱頂矢狀縫作縱行切口，暴露右側頂骨和額骨交界骨縫，按《大鼠腦立體定位圖譜》^[14]確定內囊位置，用牙科鉆鉆取小孔，緩慢注射5 μL NMDA，持續5 min，注射完畢拔出微量注射器，壓迫止血并消毒，縫合。術后均予以青霉素抗感染;腹腔注射速尿，防止腦水腫。大鼠蘇醒后，Zea Longa評分^[12]1～3分，Ashworth肌張力評分^[15]≥1分，表明腦卒中后肢體痙攣模型成功。

1.5? 干預

模型組大鼠單籠飼養，飼料喂養，投喂葡萄糖水，青霉素肌注，共4 d;假手術組同模型組，只分離不結扎也不插線;西藥組將制備好的巴氯芬水溶液按成人量換算成動物劑量，給藥體積為1 mL/100 g體質量，1次/d，連續5 d;假手術組和模型組均灌服等量生理鹽水，1次/d，連續5 d;針藥結合組大鼠針刺陽陵泉、曲池，并予加味芍藥甘草湯水煎劑灌胃。電針取雙側曲池、陽陵泉，穴位定位參照《實驗針灸學實驗指導》^[16]，并結合解剖學方法進行大鼠穴位定位。陽陵泉：距足三里（膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm處）上外側5 mm，直刺6 mm。曲池：橈骨近端關節外側前方的凹陷中，直刺4 mm。將大鼠固定于鼠板上，消毒，采用華佗牌0.3 mm×13 mm一次性針灸針，捻轉角度90～180°，頻率60～90次/min，持續1 min，針后選用SDZ-V電針治療儀，密波，頻率100 Hz，以大鼠肢體輕微抖動為度。將制備好的加味芍藥甘草湯水煎液溫熱，劑量按照成人量換算成動物劑量，灌胃體積為1 mL/100 g體質量，先行加味芍藥甘草湯灌服;再行電針治療，每次30 min，均每日1次，連續5 d。

1.6? 行為學檢測

1.6.1? 大鼠神經功能評分

參照Zea Longa評分標準^[12]進行神經功能評分：0分為無神經損傷癥狀;1分為不能完全伸展手術對側前爪或后爪;2分為行走時向手術對側轉圈;3分為行走時向手術對側傾倒;4分為不能自發行走，意識喪失。分別在造模后及治療結束后各評分1次。

1.6.2? 大鼠肌張力評分

根據改良人類Ashworth肌張力評分法^[15]，對大鼠綜合肌張力進行評分。0級：無肌張力增加，大鼠活動自如;1級：輕微增加，抓握中被動屈伸至最后有小的阻力;1⁺級：輕度增加，抓握至一半關節活動度（ROM）以上有輕度阻力增加;2級：肌張力在大部分ROM中均有較大增加，但肢體被動運動容易;3級：肌張力明顯增加，被動活動困難;4級：受累部分肢體強直性屈曲或伸直。將0、1、1⁺、2、3、4級分別記為0～5分，分數越高說明肌張力越差。分別在造模后及治療結束各評分1次。

1.7? 取材

大鼠行為學檢測結束后，采集標本。斷頭處死大鼠，冰臺上快速取大腦海馬組織放入凍存管，放入液氮降溫1 d，置于-80 ℃環境凍存備用。

1.8? RT-PCR檢測大鼠腦組織海馬區γ-氨基丁酸a型受體和腦源性神經營養因子mRNA表達

采用Trizol一步法提取總RNA，獲得RNA溶液，置于-80 ℃冰箱保存備用。RNA中DNA消除：37 ℃，30 min;Hold，加1 μL EDTA;65 ℃，10 min。總RNA中DNase1消除：將反應液加入與其等量的苯酚/氯仿/異戊醇，充分混勻，適量DEPC-H₂O溶解，進行反轉錄。反應條件：42 ℃，60 min;70 ℃，15 min;16 ℃，循環;反轉錄產物置于-20 ℃保存備用。將制備好cDNA進行PCR擴增，反應程序：95 ℃、3 min，95 ℃、5 s，56 ℃、10 s，72 ℃、25 s，39個循環;65 ℃、5 s，95 ℃、50 s。計算ΔCt值，以2^-ΔΔCt分析各基因相對表達量。以β-actin作為內參基因，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，詳見表1。

1.9? Western blot檢測大鼠腦組織海馬區γ-氨基丁酸a型受體和腦源性神經營養因子蛋白表達

將組織剪成細小的碎片，每20 mg組織加150～250 μL裂解液，勻漿直至完全裂解。裂解后4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清液，進行蛋白質定量后貯存于-80 ℃冰箱，根據目的蛋白的分子量選擇不同的凝膠濃度（6%、12%），再根據蛋白定量結果取所需蛋白加入適量上樣緩沖液，沸水浴10 min 使蛋白變性，離心，取上清液上樣。將配制好的PAGE膠放入電泳槽中，加入適量電泳緩沖液，轉膜。室溫封閉2 h后加入一抗和膜，室溫孵育1 h，膜用PBST洗滌3次×5 min。隨后根據用量，按1∶10 000稀釋HRP標記二抗，與膜室溫孵育1 h。PBST洗3次×5 min，顯色后通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。

1.10? 統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行分析。計量資料用樣本含量、±s或n、M（QR）表示，所有數據均進行正態性和方差齊性檢驗。滿足正態性及方差齊性時，組內治療前后比較采用配對t檢驗，組間比較采用方差分析，不滿足正態性或方差齊性，則采用非參數檢驗;多組間比較采用方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett'T3法;不滿足正態性選擇秩和檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? 行為學檢測結果

2.1.1? 大鼠神經功能評分結果

與空白組比較，假手術組大鼠神經功能評分無明顯差異（P>0.05），模型組大鼠神經功能評分明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01），提示造模成功;與模型組比較，西藥組和針藥結合組大鼠神經功能評分明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表2。

2.1.2? 大鼠Ashworth評分結果

與空白組比較，假手術組大鼠Ashworth評分無明顯差異（P>0.05），模型組評分明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01），提示造模成功;與模型組比較，西藥組、針藥結合組大鼠Ashworth評分明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表3。

2.2? 針藥結合對模型大鼠海馬腦源性神經營養因子和γ-氨基丁酸a型受體mRNA表達的影響

與空白組、假手術組比較，模型組大鼠海馬BDNF、GABAa mRNA表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，西藥組、針藥結合組大鼠海馬BDNF、GABAa mRNA表達均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）;與西藥組比較，針藥結合組大鼠海馬BDNF、GABAa mRNA表達變化不明顯（P>0.05）。結果見表4。

2.3? 針藥結合對模型大鼠海馬大鼠海馬腦源性神經營養因子和γ-氨基丁酸a型受體蛋白表達的影響

與空白組、假手術組比較，模型組大鼠海馬BDNF、GABAa蛋白表達均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，西藥組、針藥結合組大鼠海馬BDNF、GABAa蛋白表達均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）;與西藥組比較，針藥結合組大鼠海馬BDNF、GABAa蛋白表達變化不明顯（P>0.05）。見表5、圖1。

3? 討論

中醫學認為，中風后肢體痙攣多由陰虛血少或蹺脈病變所致，如《景岳全書》：“其病在血液，血液枯燥，所以痙攣”“凡屬陰虛血少之輩，不能營養筋脈，以致搐攣僵仆者，皆是此證，如中風之有此者，總屬陰虛證。”《難經·二十九難》“陰蹺為病，陽緩而陰急;陽蹺為病，陰緩而陽急”，其病位在筋;臨床表現筋肉拘急、屈伸不利，應歸屬于十二經筋的病候，而非十二正經的病候;治法為祛邪扶正、舒筋緩急^[17]。陽陵泉是足少陽膽經合穴，為八會穴之筋會，《針灸聚英》：“主膝伸不得屈，骸樞膝骨冷痹，腳氣，膝股內外廉不仁，偏風半身不遂，腳冷無血色，苦嗌中介然，頭面腫，足筋攣。”陽陵泉是治手足拘攣、抽搐轉筋常用穴位，是治療全身筋病要穴。曲池為多氣多血的手陽明經合穴，位于肘部，《針灸大成·卷六》言其：“主繞踝風，手臂紅腫，肘中痛，偏風半身不遂”，故曲池具有通經絡、調氣血、祛利關節、止痹痛之功。《傷寒論》云：“夜半陽氣還，兩足當溫，脛尚微拘急，重與芍藥甘草湯，爾乃脛伸。”芍藥甘草湯為治療“足痙急，不得伸”的名方，功專滋陰補肝、養血柔筋、緩急止痙，用于傷寒后誤汗亡陽、陽復而筋脈攣急之證。因此，針刺陽陵泉、曲池結合加味芍藥甘草湯能更好緩解腦卒中后肢體痙攣狀態以促進腦卒中患者的康復，提高患者生存質量。

現代醫學認為，腦卒中后中樞神經系統抑制性神經遞質GABA減少或興奮性神經遞質谷氨酸（Glu）增加都會導致痙攣^[18]。GABA作為抑制性神經遞質的代表，由腦組織內的興奮性神經遞質Glu在谷氨酸脫羧酶的作用下脫去羧基形成^[19];Glu和GABA介導的興奮性突觸傳遞和抑制性突觸傳遞是維持神經系統興奮/抑制平衡的重要基礎^[20]。其中GABAa受體是主要介導GABA導致的快速抑制性突觸傳遞的受體^[21];GABA與GABAa受體結合后，可引起突觸后膜GABAa通道開放，Cl^-電導增加，又因為大多數情況下胞內Cl^-低于胞外，所以Cl^-內流，導致突觸后膜超極化，產生快速抑制性突觸后電位，抑制神經元放電，產生突觸后抑制效應^[22]。BDNF作為神經系統發育過程中的關鍵信號分子，在中樞神經系統中對促進神經元的存活至關重要^[23]。它與GABA相互調節：GABA可以促進BDNF的轉運和表達水平^[24]，BDNF也可以促進海馬GABA的轉錄活性^[25]。研究發現，BDNF參與GABA能神經元可塑性的調節，BDNF對GABA能神經元的可塑性起著關鍵作用^[26];并且BDNF參與調節Glu和GABA能突觸的突觸后神經遞質受體的數量與分布^[27]。

研究顯示，針刺可通過升高GABA含量或增加GABA受體的表達，抑制肢體痙攣狀態;也可通過升高卒中后肢體痙攣狀態大鼠血清BDNF含量，并促進受損神經的修復，緩解肢體痙攣狀態^[17，28-30]。但關于針藥結合治療腦卒中后肢體痙攣作用機制研究鮮有報道。本研究結果顯示，針藥結合不僅可通過升高GABAa mRNA和蛋白的表達，產生突觸前和突觸后的抑制作用，而且可通過上調腦組織海馬中BDNF mRNA和蛋白的表達，促進神經功能恢復，保護神經損傷，兩者相互調節能更好地促進神經功能發育和再生，緩解卒中后肢體痙攣。因此，針藥結合防治腦卒中后肢體痙攣狀態的機制可能是通過上調腦組織海馬BDNF、GABAa mRNA和蛋白表達而實現的，這為臨床上治療腦卒中后肢體痙攣提供了理論依據。

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（收稿日期：2019-05-03）

（修回日期：2019-06-20;編輯：華強）

基金項目：國家自然科學基金（81673886）;湖南省自然科學基金（2018JJ2294）;湖南省中醫藥科研計劃項目（201828）;湖南省研究生科研創新項目（CX2018B488）

通訊作者：岳增輝，E-mail：624755064@qq.com