強化曲中畢赤酵母與地衣芽孢桿菌的相互作用研究

霍穎玙，馮儒志，黃洲明，李 勇，周宗艾，邱樹毅

（1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽 550025；3.海南正生堂食品科技有限公司，海南海口 570216；4.貴州仁懷宏盛酒業有限公司，貴州仁懷 564501）

酒曲在白酒釀造過程中起著至關重要的作用。中國的醬香型白酒制曲工藝是高溫制曲，“高溫”的特點同時也加速了化學反應、生物化學反應、褐變反應與美拉德反應的進行，生成了大量的香氣成分。這使得釀造出的白酒醬香風味濃郁。

高溫大曲中芽孢桿菌的數量占很大的比例[1]。芽孢桿菌在醬香型白酒生產過程中擔任著產香功能細菌的角色，它可以分泌如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等豐富的酶系，這些酶系推動了小麥，高粱等原料分解，形成豐富的氨基酸與糖類，從而促進醬香風味的生成[2-3]。利用純培養技術，將功能性細菌加入制曲過程中進行培養，制作功能性強化大曲，可以達到豐富風味物質以及提高白酒風味質量的目的。孟天毅等[4-5]對生產車間的強化高溫大曲進行了分析，結果表明，強化大曲中的微生物與成品曲基本一致，且強化大曲的醬香風味更加突出，而成品曲則是曲香突出；強化大曲產酒醬香更加濃郁、酒體爽凈，而成品曲則顯得更加豐滿、醇厚。楊濤等[6]將醬香大曲中所分離到的地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等按一定比例混合制成三級種子液，后在拌料階段加入到制曲過程，試驗所得強化大曲的液化力、蛋白質水解力均有明顯提高，并且大曲中游離氨基酸含量有所增加，運用到釀酒階段時，糟醅的各項理化指標均有提升，釀制酒液的品質優良。

酵母菌有利于白酒的呈香作用[8-11]。但在高溫制曲過程中，由于溫度的升高不利于酵母菌的生長。王曉丹等[7]曾在醬香型白酒的酒醅中篩選出畢赤酵母，并發現其擁有較強的產酒產酯能力。所以，對于制作強化曲來說，如何將功能芽孢桿菌與功能酵母菌同時利用到強化曲的制作中，豐富強化曲的風味物質，提高酒曲的品質至關重要[12-18]。同時研究在酒曲制作過程中芽孢桿菌與酵母菌的相互作用，以及有益代謝物的產生可以幫助我們更好的了解微生物之間在酒曲發酵過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌種

地衣芽孢桿菌、畢赤酵母均由本課題組從貴州茅臺鎮醬香型白酒生產用曲中分離篩選得到。

1.1.2 試劑及培養基

干酪素（分析純）、無水碳酸鈉（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純），天津市海光化學試劑廠；福林酚（分析純），北京索萊寶生物科技有限公司；三氯乙酸（分析純）、冰乙酸（分析純）、乙酸鈉（分析純），重慶北碚精細化工廠；磷酸氫二鉀（分析純），成都市科龍化工試劑廠。

YEPD培養基、LB培養基、孟加拉紅培養基、營養瓊脂培養基購于化學試劑商店。

小麥粉培養基：5 g 小麥粉中加入100 mL 水，振蕩混勻，自然pH，121 ℃滅菌20 min。小麥粉，山東楊湖酒業有限公司。

1.1.3 儀器設備

離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；Stable Flex 纖維頭（DVB/CAR/PDMS），美國Supelco 公司；7890A-5975C 氣相色譜質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯用儀，安捷倫科技有限公司；FA1004 電子天平，上海箐海儀器有限公司；KQ-300DE 數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液的制備

畢赤酵母種子液：從PDA 培養基中挑取1 環活化好的酵母菌菌苔于YPD 培養基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養48 h。

地衣芽孢桿菌種子液：從營養瓊脂培養基中挑取1 環活化好的芽孢桿菌菌苔于LB 培養基中，以37 ℃、150 r/min培養24 h。

1.2.2 芽孢桿菌對酵母細胞生長的影響

選取葡萄糖、蛋白胨和地衣芽孢桿菌發酵液作為組分，設計培養基如表1 所示。取0.5 mL 酵母種子液加入2 mL 無菌離心管中，于8000 r/min 離心10 min，去除上清液，并在沉淀中加入0.2 mL 無菌水，混勻后全部接入50 mL 酵母生長培養基中（接種量1%），于180 r/min 條件下培養24 h，并測定生物量。

表1 酵母生長培養基

1.2.3 地衣芽孢桿菌與畢赤酵母共培養研究

取1.0 mL 酵母或0.5 mL 芽孢桿菌種子液加入2 mL 無菌離心管中，于8000 r/min 離心10 min，去除上清液，并在沉淀中加入0.2 mL無菌水，混勻后全部接入50 mL小麥粉培養基中，于30 ℃、180 r/min條件下培養，每24 h取樣用于測定菌落數。

1.2.4 畢赤酵母與地衣芽孢桿菌制作強化曲研究

畢赤酵母與地衣芽孢桿菌不同比例下混合發酵。地衣芽孢桿菌與畢赤酵母以1∶0.1、1∶0.5、1∶1、1∶5、1∶10 的接種比例同時接種于小麥固態培養基。接種后地衣芽孢桿菌的數量為5×106CFU/g，放于30 ℃培養箱中靜置培養。

1.2.5 樣品生物量測定

稱取10 g 樣品放于盛有90 mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩30 min，取1 mL 充分稀釋，吸取稀釋液涂布于培養基中，培養計數。

1.2.6 粗酶液的制備及酶活測定

250 mL 三角瓶中加入10 g 樣品，再加100 mL蒸餾水，在40 ℃的條件下水浴1 h，每15 min 攪拌1次，然后用定性濾紙過濾，將開始的5 mL 棄去，之后過濾濾液為測定酶活所需的粗酶液。

酸性蛋白酶活力檢測：參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》對樣品的酸性蛋白酶進行測定。

淀粉酶活力檢測：采用改良Young J.Yoo 法[19]。

1.2.7 大曲理化指標的測定

參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》中的測定方法對大曲水分、淀粉、酸度、液化力、糖化力、酯化力、發酵力進行測定。

1.2.8 GC-MS分析實驗

采用頂空固相微萃取（HS-SPME）技術結合GC-MS分析麥曲中揮發性成分[20-22]。

樣品處理：取麥曲粉0.2 g加入5 mL水中，超聲波處理30 min。GC-MS 條件：安捷倫6890N 氣相色譜配備5975 質譜儀。毛細管柱DB-Wax(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm)，進樣口和檢測器溫度均為250 ℃，載氣為He，流速2 mL/min。程序升溫：起始溫度50 ℃，保持2 min，然后以2 ℃/min的升溫速率升溫到85 ℃，保留0.1 min，再以5 ℃/min 的升溫速率升溫到230 ℃，保持2 min。電子轟擊能量70 eV，離子源溫度230 ℃。質譜分析用數據庫為Wiley275.L(Agilent公司)和NIST庫。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌對酵母菌生長影響情況（表2）

表2 畢赤酵母的生物量情況

根據表2 可知，地衣芽孢桿菌FBKL1.0199 對所選酵母的生長無抑制作用。畢赤酵母在只有地衣芽孢桿菌發酵上清液的培養基中有微弱的生長能力，但加入微量的葡萄糖和蛋白胨后生長能力獲得了極大的提高，菌落總數從之前的不足103CFU/mL增加到1.45×107CFU/mL，除此之外，葡萄糖的添加也對畢赤酵母的生長有促進作用。在只有蛋白胨和發酵液的培養基中畢赤酵母的菌落總數小于104CFU/mL，而在此培養基的基礎上添加了葡萄糖后，菌落總數增加到1.45×107CFU/mL。而且在只有葡萄糖的培養基中，畢赤酵母的菌落總數可達到3.3×106CFU/mL，添加微量氮源可以使酵母數量增加。由此可知，即使有地衣芽孢桿菌的存在，只要提供了畢赤酵母生長的營養成分，酵母還是可以很好的生長。

2.2 地衣芽孢桿菌與畢赤酵母共培養規律研究（圖1）

在混培養體系中，畢赤酵母的最高生物量均在發酵中期，為2.96×109CFU/mL。畢赤酵母數量在培養的前72 h 內持續增加，之后便持續下降，在發酵終點畢赤酵母數量為1.14×109CFU/mL。發酵24 h 時，在混酵體系中畢赤酵母比例為16.87%，發酵中期畢赤酵母比例可上升到31%～34%，發酵終點時畢赤酵母比例又降到了12.33%。可見，在混培養體系中，畢赤酵母與地衣芽孢桿菌的混酵過程以地衣芽孢桿菌的增殖為主。在混培養體系中，畢赤酵母菌與地衣芽孢桿菌可以共同培養，地衣芽孢桿菌的增殖速度大于畢赤酵母菌的增長速度。同時研究表明，在小麥粉與水組成的小麥粉培養基中，地衣芽孢桿菌與畢赤酵母不存在明顯的相互抑制的情況，所以可以將其利用于強化麥曲的制備，以達到提高麥曲品質的目的。

2.3 強化曲發酵過程中畢赤酵母與地衣芽孢桿菌生物量的變化（圖2、圖3）

地衣芽孢桿菌在發酵過程中一直呈生長優勢，每隔2 d 以102左右的生長速率增長。在不添加畢赤酵母的實驗組中，發酵14 d 以后，樣品的地衣芽孢桿菌菌落總數可達到1.1×1017CFU/g。除此之外，在地衣芽孢桿菌與畢赤酵母以1∶10 的接種比例接種的實驗組中，同樣在發酵14 d 以后，地衣芽孢桿菌菌落總數可達到5.6×1016CFU/g。由此可知，添加畢赤酵母對地衣芽孢桿菌生長情況影響不大，地衣芽孢桿菌仍為混合培養體系中的優勢菌。畢赤酵母在混合體系中培養的14 d 內，酵母菌總數始終維持在108～109CFU/g。混合體系發酵前期，生長速率較緩慢，在中期加速增長，發酵后期生長速率減慢，這可能是因為在發酵前期，小麥中的營養物質畢赤酵母還不能直接應用，所以酵母生長速度緩慢。但是隨著地衣芽孢桿菌的生長，其代謝出來的酶將小麥中淀粉等營養物質分解成畢赤酵母可利用的糖類物質，滿足酵母的生長條件，故而在中期生長迅速。在發酵后期由于營養物質的利用減少，生長速率也慢慢減少了下來。所以在混合培養體系中，地衣芽孢桿菌與畢赤酵母都可增長，地衣芽孢桿菌的產酶能力，對畢赤酵母的生長也有益處。所以，在強化曲的制作過程中，地衣芽孢桿菌與畢赤酵母都有一定的生物量，他們的生長對各種代謝產物的產生提供了可能。

2.4 發酵過程中混合體系酶活變化情況（圖4、圖5）

如圖4、圖5 所示，對照組為只添加芽孢桿菌的純培養發酵體系。在不同比例的混合發酵體系中，地衣芽孢桿菌迅速生長，產生大量的代謝產物。其中在發酵前8 d，酸性蛋白酶的酶活快速增加。在這之后增長速度減小，最后曲線趨于平穩。在發酵結束時，酸性蛋白酶的酶活可達到1100～1300 U。添加酵母比例大的樣品，在發酵前4 d時，酸性蛋白酶活遠低于添加酵母比例小的樣品。但在發酵后期，酶活迅速增長，最后與對照組相差不大。發酵前期，大量的酵母菌占據了生長優勢，隨著發酵的進行，地衣芽孢桿菌的迅速增長，進而產生了更多的代謝產物，提高了酶活。而且，與對照組相比，酶活的變化趨勢并沒有太大的差異。酵母菌的添加對酸性蛋白酶酶活的影響并不大。同樣，對于淀粉酶的生長情況也沒有太大的影響。淀粉酶酶活在發酵期的前8 d 迅速增長，發酵到第8～10 天時酶活趨于平穩，第10 天至發酵結束淀粉酶活緩慢降低，在發酵結束時，淀粉酶酶活可達到530～630 U。可見，地衣芽孢桿菌在混培養體系中可以不受酵母菌生長的影響，產生有利于小麥分解的酸性蛋白酶與淀粉酶。

2.5 麥曲的理化指標檢測結果（表3）

不同接種比例的強化曲酸度變化不大。其中酸度最高的為接種比例為1∶5 時，達到3.3。接種比例為1∶0.5 時的樣品酸度值最小，為2.5。只添加細菌發酵的對照組酸度值可達到3.79，而只添加酵母菌發酵的對照組酸度值僅有0.37，傳統大曲的酸度為1.39。可見，酵母菌并不會對強化曲的酸度有太大的影響，而且酵母菌的存在稍微降低了強化曲的酸度，但添加細菌制作的強化曲的酸度略大于傳統大曲的酸度。

淀粉的消耗與芽孢桿菌的添加相關。原料小麥中的淀粉含量為74.47 g/100 g，而強化曲的淀粉含量均在40.9～42.55 g/100 g。在只添加酵母菌的對照組中，淀粉含量為65.4 g/100 g，而只添加細菌發酵的對照組淀粉含量最少，為32 g/100 g。由此可見，芽孢桿菌越多對淀粉的消耗量越大。因為，芽孢桿菌可分解多種酶類，對原料淀粉進行水解代謝成小分子產物，以便于微生物后續的發酵利用。

各個接種比例的強化曲糖化力都相差不大。只添加酵母發酵的強化曲未檢測出糖化力。而只添加細菌發酵的對照組糖化力最高為88U，其中傳統大曲的糖化力為268 U。所以，強化曲的糖化力主要來源于細菌的代謝作用。細菌除了代謝產生蛋白酶與淀粉酶以外，還會代謝產生糖化酶。故而，添加細菌發酵的強化曲有一定的糖化力，但糖化力不高。

在添加細菌發酵的強化曲中均有檢測出液化力，而只添加酵母菌發酵的對照組中，未檢測出液化力。且不同的接種比例的樣品，液化力并沒有太大的變化。其中傳統大曲的液化力為0.58，強化曲的液化力高于傳統大曲的液化力。酵母的添加對液化力沒有太大影響，細菌對強化曲的液化力有主要貢獻意義。

接種比例為1∶10 的樣品發酵力最高，為1.2。不同的接種比例之間，隨著酵母菌添加量的增加發酵力逐步上升。只添加細菌的對照組中發酵力最低，僅有0.68。而且，傳統大曲的發酵力為0.55，強化曲的發酵力高于傳統大曲。由此可知，強化曲的發酵力主要來源于酵母菌的生長。酵母菌有較強的產酒精能力、較高的耐酒精能力與耐酸能力。它在酒化酶的作用下可以將糖轉化為酒精。

表3 強化麥曲的理化指標

當接種比例為1∶10 時，強化曲的酯化力最高達到73.84。而不添加酵母以及添加酵母含量較低的樣品中酯化力均在33 以下。只添加酵母的對照組中酯化力為66.8，傳統大曲的酯化力為60.3，添加酵母菌制作的強化曲酯化力高于傳統大曲的酯化力。酵母菌的生長對酯化力有貢獻作用。酵母菌對酯、酸有酯化能力，可以形成大曲的酯類香氣。大量的酵母菌可以代謝產生酯化酶。而細菌可以代謝產生酸類物質，給酵母菌提供原料，促進酯化反應。

綜上所述，對發酵結束后的幾組強化麥曲進行理化指標的檢測分析，根據上表的數據可知，添加功能酵母發酵培養以后，對所得麥曲的酯化力有一定的提高作用，只添加細菌培養的麥曲酯化力為33.2 U，而添加酵母菌進行發酵以后酯化力可以提高到73.84 U。對于發酵力而言，酵母的添加對麥曲的發酵力有提升，從不添加酵母的0.68 提升到1.2。而添加酵母幾乎對酸度、糖化力、液化力的理化指標沒有什么影響。畢赤酵母的添加對強化曲的品質影響隨著畢赤酵母添加量的增加而逐步增大，地衣芽孢桿菌與畢赤酵母的混合比例1∶10 時制作出的強化麥曲的理化指標影響效果較為明顯。

在初始含水量一致的情況下，隨著酵母菌添加量增加，水分含量會隨之小范圍降低。其中，僅添加酵母菌發酵的對照組水分含量最低，為35.06%，遠低于只添加細菌發酵的對照組水分含量55.7%。強化曲的水分含量高于傳統大曲的水分含量。由于所檢測的傳統大曲是在白酒實際生產中所用的高溫大曲，而強化曲樣是在實驗室培養的，所以水分含量普遍偏高。

2.6 GC-MS風味物質分析結果

將地衣芽孢桿菌與畢赤酵母混合比例為1∶10的發酵之后的麥曲樣品進行HS-SPME 結合GCMS 分析。麥曲GC-MS 總離子圖見圖6。成分分析見圖7。

由圖6、圖7 可知，麥曲中共檢測到17 種物質，醛類物質1 種，醇類物質4 種，酸類物質2 種，吡嗪類物質4 種，呋喃類物質1 種，酚類物質3 種，醚類物質1 種，未檢測出酮類物質。其中，吡嗪類物質含量最高，可達到19.268%，以四甲基吡嗪為主，百分比含量為16.365%。

其次是醛類化合物，所占百分比含量為5.519%，其中以苯乙醛為主，所占百分比含量為5.281%。酸類物質占總體風味物質的4.068%，醇類物質的百分比含量為7.334%。

總體來說，此麥曲檢測出來風味物質較少，這可能是因為該強化曲的發酵過程全程是控制在雙菌發酵的。強化曲中菌落的單一性導致了風味物質產生較少。但是，吡嗪類物質的百分比含量較高，可達19.168%，吡嗪類物質對白酒的醬香風味是有貢獻意義的。除此之外，2,3-丁二醇不僅是白酒中重要的風味物質，又是重要的中間化合物前體，可氧化為3-羥基丁酮和2,3-丁二酮，同時這兩種物質也是白酒中的重要風味物質。高級醇苯乙醇和4-羥基-苯乙醇是白酒中助香劑和醇甜的主要成分，是白酒中風味物質。可見功能菌種的加入，對于豐富麥曲中的醬香風味是有意義的。

3 結論

研究了在小麥培養基中，地衣芽孢桿菌與畢赤酵母的相互作用。設置了多個菌種混合比例，以不同的菌種添加比例去制作強化麥曲，研究可以提高強化麥曲的品質的最佳接種比例，也跟蹤分析了在強化麥曲制作過程中微生物生物量，以及代謝產物產生情況。畢赤酵母菌的存在并不會對地衣芽孢桿菌的生長產生影響。在強化麥曲的制作過程中，地衣芽孢桿菌的生長一直處于一個上升的趨勢，酵母菌的生長則處于一個先上升后降低的趨勢。對強化麥曲進行GC-MS 風味物質分析可知，麥曲的風味物質雖然種類很少，但是在已檢測出來的風味物質中，吡嗪類物質百分比含量最高，可達到19.268%，其中四甲基吡嗪百分比含量為16.365%。