津酒老窖泥己酸菌的篩選及培養條件的優化

劉宏媛，李春旭，張錦濤，韓曉東，王津穎

（天津津酒集團有限公司，天津 300130）

在濃香型大曲酒的生產中，發酵窖池窖齡越長，產酒的酒質就越好，這是由于老窖中富含多種厭氧功能菌，它們參與濃香型白酒的生香過程[1]。濃香型白酒的主體香氣成分是己酸乙酯，而己酸乙酯是靠己酸菌產己酸與乙醇作用而產生的，由此可見，窖泥中的己酸菌是生成己酸乙酯的主要來源，與出酒的品質有著緊密的聯系[1，5]。為此，本實驗對津酒老窖泥中的己酸菌進行分離純化，并對其培養條件進行優化，以期為人工老窖泥的培育提供支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

材料：窖泥（采自天津津酒集團老窖池）。

試劑：乙酸鈉、硫酸銨、酵母膏、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、蛋白胨、乙醇、混合內標液（2%叔戊醇，2%醋酸正戊醇，2%2-乙基正丁酸）等。

1.2 儀器與設備

手提式滅菌鍋、恒溫培養箱、顯微鏡、FID 檢測器，CDMC色譜工作站等。

1.3 培養基的制備

改良巴氏培養基[1]：乙醇20 mL(滅菌后，接種前添加)；硫酸銨0.5 g；乙酸鈉5 g；磷酸氫二鉀0.4 g；硫酸鎂0.2 g；酵母膏1 g；碳酸鈣10 g(滅菌后，接種前添加)；蛋白胨4 g；水1000 mL。

斜面的制作[2，5]：配制液體培養基，加瓊脂3%～4%，加熱融化后分裝于各試管內，不超過試管高的1/5，加塞包扎后于0.1 MPa 滅菌30 min，置于無菌室冷卻至約60 ℃，加入2%的酒精，趁熱擺放斜面，待其凝固后置于真空干燥器中，抽真空至0.08 MPa，34 ℃恒溫培養3 d，以檢查滅菌是否徹底，如斜面有雜菌加以剔除。

1.4 己酸菌的分離純化

1.4.1 種子液的制備[2-3]

稱取1 g 優質老窖泥，加入液體培養基內，80 ℃水浴10 min，待冷卻至30～40 ℃，于無菌條件下加入乙醇2～3 滴，加塞包扎，放置于真空干燥器內，抽真空至0.08 MPa，34 ℃培養7～10 d。

1.4.2 富集培養[3-4]

挑取產氣較早、較多且氣泡較大的試管，80 ℃水浴10 min，待冷卻后按照15%的接種量接于裝有液體培養基的試管內，培養條件參照1.4.1培養5 d。

1.4.3 平板分離

挑取產氣多、氣泡較大的試管，于80 ℃水浴10 min。在無菌的條件下，用一支1 mL 無菌吸管吸取己酸菌液1 mL，加入盛有9 mL 無菌水的試管中充分混勻，然后用無菌吸管從該試管中吸取1 mL加入另一盛有9 mL 無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1～10-6不同稀釋度的己酸菌液。取10-3～10-6濃度的菌液各1 mL，加入空培養皿中，倒入融化保溫的固體培養基，手掌平托培養皿緩慢搖晃幾圈，以使菌液與培養基混合均勻。待培養皿凝固后，培養條件參照1.4.1，培養3 d。

斜面轉接：無菌條件下，挑選形態規則的菌落轉接于試管斜面，培養條件參照1.4.1，培養3～5 d。

1.4.4 初篩

斜面試管抽真空培養3～5 d 后，有菌落長出，用滅菌后的接種針挑取少許菌落，置于滴有無菌水的載玻片上，于顯微鏡下觀察，從中挑取游動活潑、長短桿狀，最好是呈鼓錘狀芽孢的菌株作為初篩菌株。

1.4.5 己酸定性檢測

硫酸銅顯色法：發酵液1 mL，置于試管中，加入乙醚0.5 mL，再加入2%硫酸銅溶液1 mL，充分搖動混勻，放置分層后，在兩層中間呈藍色即證明有己酸的存在，顏色越深，己酸的含量越高。

1.4.6 己酸菌培養液中己酸含量的檢測

直接進樣毛細管柱氣相色譜法：分析白酒采用混合內標（2%叔戊醇，2%醋酸正戊醇，2%2-乙基正丁酸）來測定己酸菌液中的有機酸。

1.4.6.1 儀器及條件

FID檢測器，CDMC色譜工作站。

色譜柱為毛細管柱PEG-20M，檢測器溫度250 ℃，汽化溫度220 ℃。

程序溫度：起始溫度50 ℃，恒溫2 min 后以3.5 ℃/min 速率升至200 ℃，繼續恒溫10 min，分流比40∶1。

1.4.6.2 樣品處理

取樣品50 mL，活性炭吸附，靜置，過濾，取清濾液20 mL 加鹽酸酸化至pH2，用無水乙醇稀釋至40 mL，搖勻；于10 mL 具塞試管中準確移入10 mL處理后的樣品，加入0.1%三內標混合液（10 mL×0.1=10 μL）搖勻，進樣量為1 μL。

1.5 己酸菌培養條件的優化

選定酒精濃度（%vol）、pH 值、培養溫度(℃)和蛋白胨含量(g/L)4 個因素為影響己酸菌生長的主要因素，構建4 因素4 水平的正交表，進行正交試驗。在試驗過程中采用血球計數板計數法對1 mL己酸菌液中的活菌數進行計算，采用直接進樣毛細管柱氣相色譜法對己酸菌液中己酸含量進行檢測。因素水平表和正交試驗表見表1、表2。

表1 培養因素水平表

2 結果與分析

2.1 窖泥中己酸菌的分離培養

對津酒窖泥中的己酸菌進行分離純化，得到2株己酸菌，并命名為菌1、菌2，其菌落形態和鏡檢形態見表3。

2.2 己酸菌培養條件的優化結果

由硫酸銅顯色法的初步檢測可知，菌2 的己酸含量較高，因此選定菌2 為試驗菌株；因素水平表參見表1，試驗方案及結果見表2，試驗結果分析見表4。

表2 試驗方案及試驗結果

表3 己酸菌的特征

由表4 可知，對于不同的指標而言，不同因素的影響程度是不一樣的，不同指標的優選方案有所差別，通過綜合平衡法可以得到綜合的優方案，具體平衡過程如下：

因素A：對于己酸菌數量和己酸含量都是取A4為最佳水平。

因素B：對于己酸菌數量和己酸含量都是取B2為最佳水平。

因素C：對于己酸菌數量和己酸含量都是取C1為最佳水平。

因素D：對于己酸菌數量取D4好，對于己酸含量取D3好，因為對于己酸含量，因素D 為較重要因素，所以選取D3為最佳水平。

綜上分析可知，最優方案為A4B2C1D3，即酒精濃度為3%vol、pH 值為6、培養溫度34 ℃、蛋白胨含量為4 g/L為己酸菌2的最適生長條件。

3 結論

3.1 己酸菌孢子有耐熱性，而營養細胞不耐熱，因此為了純化菌種，多采用熱處理的方法，本試驗采用80 ℃水浴的方法取得了較好的效果。

表4 己酸菌數量試驗結果分析

3.2 己酸菌在偏酸性(pH6)的環境下生長旺盛；添加一定量的酒精(3%vol)即可起到選擇性培養的作用，亦可促進己酸菌的生長；己酸菌在30～36 ℃均能生長，但在34 ℃時其生長最為旺盛；簡化巴氏培養基中添加蛋白胨為筆者一次偶然試驗所得，加入少量的蛋白胨可促進己酸菌的生長繁殖，這可能是因為蛋白胨營養較為豐富，含有多種適宜己酸菌生長的成分。由于試驗條件所限，并未對此進行更深一步的探討。

表5 己酸含量試驗結果分析

3.3 己酸菌在白酒中的應用主要用于加快窖泥的老熟，從而提高出酒質量。本試驗從津酒的窖泥中分離純化出兩株己酸菌，采用硫酸銅顯色法對其己酸產量進行粗測，采用直接進樣毛細管柱氣相色譜法對己酸含量進行檢測，結果見表5。并對其培養條件進行優化，以為后續人工老窖泥的培育、己酸菌液在窖泥中的養護等研究提供基礎。