高產乙酸乙酯酵母菌株的篩選

陳 雪，孟勤燕，齊 歡，王 珍，李浩浩，閆宗科

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西鳳翔 721406）

白酒是我國傳統的釀造食品，是以高粱等淀粉質原料為主料，采用大曲作為糖化、發酵劑，經固態發酵和蒸餾而制成的一種飲料酒[1-2]。作為中國特有的傳統酒種，白酒是中華民族的瑰寶，是世界六大蒸餾酒之一，以其香型多樣、工藝特殊，色澤、香氣、口味、風格獨樹一幟[3]。白酒除98%的乙醇和水以外，其余2%主要為酸、酯、醇及其他一些微量組分。尤其是酯類的含量和比重決定著白酒的香型和品質[4]。

乙酸乙酯是我國白酒中含量較多的香味物質之一，尤其是對清香型、鳳香型和米香型等白酒的風格及成型具有重要作用[6]。乙酸乙酯沸點為77 ℃，感官閾值為17.0 mg/L（32 m g/L），具有蘋果味香氣，刺激帶澀，味短[7]。乙酸乙酯主要由微生物尤其產酯類酵母代謝產生。產酯酵母又稱生香酵母，主要包括產酯酵母和假絲酵母，是白酒產香的主要菌種之一，產酯酵母主產乙酸酯類，特別是乙酸乙酯[9]。產酯酵母能夠以乙醇為碳源，既具備乙醇發酵能力，又具備醋酸發酵能力，能以糖、醛、有機酸、鹽類等物質為養料，在酯酶作用下合成酯類[10]。目前已報道的高產乙酸乙酯的酵母主要是漢遜酵母[11-12]、假絲酵母、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、異常畢赤酵母（Picha anomala）[12-13]、平常假絲酵母（Candida inconspicua）[10]等酵母種屬。

如何提高白酒中酯類的含量是白酒生產者普遍關注的問題。20 世紀70 年代以來，我國許多酒廠采用純種培養產酯酵母，應用于白酒生產，顯著改善及提高了酒質，產酯酵母的功能因此受到人們的重視。鳳香型白酒其主要香氣是以乙酸乙酯為主，己酸乙酯和高級醇為輔的復合香氣。因此，篩選適合鳳香型白酒釀造的優質高產乙酸乙酯功能菌株，對鳳香型白酒優質高效釀造具有實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌株、試劑

菌種：企業技術中心保藏的酵母菌株22 株、酒醅中分離的酵母菌株78株。

試劑及耗材：酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、麥芽浸粉、鹽酸、氯化鈉、硫酸、無水乙醇。

1.1.2 培養基

麥芽汁培養基：12°Bx 麥芽汁，分裝，115 ℃滅菌20 min。

YPD 液體培養基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1000 mL，以115 ℃滅菌30 min。

PDA 液體培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1000 mL，115 ℃滅菌30 min。

TTC 下層培養基：葡萄糖10.1 g，蛋白胨2.0 g，酵母浸粉1.5 g，瓊脂30 g，酸性磷酸鉀1.0 g，硫酸鎂0.4 g，檸檬酸0.27 g，水200 mL。

TTC 上層培養基：TTC 0.5 g，葡萄糖0.5 g，瓊脂1.5 g，水100 mL。配制5%TTC 溶液（避光下用溫水溶解，經0.22 μm 醋酸纖維膜過濾后，4 ℃冰箱保存備用）待培養基溫度降到50 ℃，添加1 mL 到100 mL培養基中。

高粱汁：取高粱粉1 份，加入4 份自來水煮1～2 h，按使用說明加入淀粉酶液化，液化后補加60 ℃溫水1 份，加入原料量的5%糖化酶（5 萬活力單位），攪拌均勻，以60 ℃糖化3～4 h，用稀碘液試之不顯藍色，再加熱至90 ℃。用細紗布過濾后加熱濃縮。調整糖度至12°Bx，20%硫酸調至pH4.5，分裝至三角瓶中，115 ℃，滅菌20 min。

固態發酵培養基：粉碎后高粱300 g，加90 ℃水270 mL，90 ℃潤糧5 h，100 ℃滅菌120 min。取出攤晾，加入45 g 清蒸稻殼，添加1%乙酸，無菌水調整水分在63%～65%。

1.1.3 儀器設備

生化培養箱、恒溫調速回轉式搖床、冷凍高速離心機、紫外分光光度計、顯微鏡、微生物鑒定。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌株的分離純化

取高產乙酸乙酯班組的酒醅，稱取10 g 酒醅于含90 mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，200 r/ min 振蕩浸提30 min，吸取上清液，稀釋到合適濃度，選3個濃度梯度，取200 μL 涂布于孟加拉紅平板。30 ℃培養3 d 后，挑取生長良好的酵母單菌落進一步劃線分離2～3 次，經鏡檢為純種后分別轉入YPD固體斜面，培養好后4 ℃冰箱保藏[14]。

1.2.2 高產乙酸乙酯酵母的篩選

初篩：菌株經活化接入12°Bx麥芽汁液體培養基，30 ℃培養7 d，每株菌做2 個平行，進行風味嗅聞評定，記錄各菌株酯香味（香蕉、蘋果等香味）的強弱。同時以不接菌的平板和液體培養基為空白，篩選出酯香濃郁、香氣獨特的酵母菌。

復篩：復篩酵母菌在液體YPD 中活化，30 ℃，100 r/min，16～24 h。以相同接種量（1×107cfu/mL）分別接入裝有120 mL 12 °Bx 高粱汁的三角瓶中，安裝發酵栓并稱重，置于30 ℃培養箱中恒溫培養，每隔24 h 稱重，記錄失重量，當失重量小于0.2 g 時停止培養，每個菌做2 個平行。發酵結束后，測理化指標和乙酸乙酯含量。

乙酸乙酯的測定：取100 mL 發酵液至500 mL圓底燒瓶中，加入100 mL 60%乙醇進行蒸餾，收集100 mL 餾分[11]，皂化法測定總酯，同時以40%vol無酯酒精做空白?？傰ジ叩臉悠?，繼而用氣相色譜測定乙酸乙酯的含量。

1.2.3 高產乙酸乙酯酵母耐受性的測定

酒精耐受性：在試管中添加YPD 液體培養基5 mL 并加入杜氏管，滅菌之后分別加入無水乙醇調整初始酒精濃度為8%vol、10%vol、12%vol、14%vol，將活化好的菌株按接種量為106cfu/mL接入，設置3個平行，30 ℃恒溫靜置培養，每隔12 h觀察產氣，觀察10 d。

同理測定溫度（32 ℃、35 ℃、38 ℃、40 ℃）耐受性，酸度(初始pH 值為2.5、3.0、3.5、4.0)耐受性，恒溫靜置培養，每隔4 h 觀察產氣，3 d 后在600 nm 條件下測定吸光度。

1.2.4 優選菌株發酵條件的優化

正交實驗：考察發酵溫度、發酵時間、pH 值、酒精度4個因素對其產乙酸乙酯量的影響[16]，按L16(45)進行正交試驗設計，正交試驗因素與水平見表1。

通過正交試驗獲得酵母菌株產酯的最佳工藝條件，進行3次在該優化產酯條件下的驗證試驗。

1.2.5 固態發酵小試

模擬鳳香型白酒生產工藝，固態發酵培養基攤晾至溫度30 ℃左右添加20%大曲，MY0-3 酵母菌接入量為1×107cfu/g，拌勻后每3000 g 分裝入5 L玻璃罐中，蓋上塞子，纏上保鮮膜，置于恒溫培養箱中，30 ℃培養。20 d 發酵結束后，測定乙酸乙酯和基本理化指標（水分、酸度、還原糖、酒精度）。

2 結果與分析

2.1 酵母菌株的分離

在酒醅中共分離出78 株酵母菌株，在平板上進行聞香及TTC 顯色試驗。篩選出具有濃郁香氣的菌株為1-5、7、10、13、16、17、73-75、25、26、28、32、33、41、43、57、59、69-72，共計26 株，具體結果見表2。

表2 分離菌株的平板篩選

2.2 高產乙酸乙酯菌株的篩選

初篩：對26 株篩選的酵母菌株進行活化，以106cfu/mL 濃度接入50 mL、12°Bx 麥芽汁，30 ℃培養7 d 后進行聞香。篩選出7、10、13、17、25、43、59、57、71、72、74，共計11 株菌株，具有中等至濃郁的香氣。通過微生物鑒定儀進行菌株鑒定，鑒定出6株，結果見表3。

液體發酵復篩：將產酯的強化菌株4 株、現存相關酵母菌株20 株以及酒醅中篩選的酵母6 株，共計30 株。統一進行12 °Bx 高粱汁液體發酵，發酵結束后，測總酯及基本理化指標，選總酯較高的樣品測定乙酸乙酯含量，實驗結果見表4。產乙酸乙酯含量最高的菌株是MY0-3，乙酸乙酯產量達到3.73 g/L；其次具有高產乙酸乙酯潛力的菌株為MY5-9、B003、C3、B005、Y1、P6、74，乙酸乙酯產量分別為0.63 g/L、0.46 g/L、0.35 g/L、0.33 g/L、0.23 g/L、0.33 g/L、0.16 g/L。其中MY0-3 具有高產乙酸乙酯、低產乙醇、增酸及發酵較徹底的特點；C3 具有低產乙醇、發酵較徹底、產酸最少等特性；Y1、B003、B005、74具有高產酒精特性。

表3 聞香優選菌株

表4 液體發酵復篩結果

2.3 優選菌株耐受性（圖1、圖2，表5—表7）

結果顯示，MY0-3、B003、B005 具有較低的酒精耐受性，最高耐受8%vol；C3、MY5-9、Y1最高耐受10%vol 的酒精，P6、74 酒精耐受性最高，可耐12%vol～14%vol 的酒精。菌株MY0-3 和MY5-9最高耐受3.0 的酸度，其他均可耐受2.5 的酸度。MY0-3 和B005 最高耐受35 ℃，B003 最高耐受溫度為38 ℃，C3、Y1、P6、74、MY5-9 均可耐受41 ℃的溫度。綜合以上，菌株MY0-3 具有較低的酒精耐受性和溫度耐受性，P6、74 具有較高酒精耐受性和溫度耐受性。

表5 優選菌株的酒精耐受性(產氣)

表6 優選菌株的溫度耐受性(產氣)

2.4 產酯條件優化

L16(45)正交試驗進行產酯發酵條件優化，以乙酸乙酯的產量為評價指標，選擇發酵溫度、發酵時間、pH值、酒精度4個因素，研究其對高產乙酸乙酯MY0-3 菌株產酯的影響，確定最佳的產酯工藝條件，正交試驗結果與分析見表8，方差分析結果見表9。

由表9可知，各影響因素對酵母MY0-3產酯的影響程度為RC＞RD＞RA＞RB，即發酵溫度＞發酵時間＞pH 值＞酒精度。綜合分析得到產酯最佳方案為A2B2C1D4，即發酵溫度25 ℃，發酵時間9 d，pH3.5，酒精度2%vol。在該優化產酯條件下，通過3 次驗證試驗，得到酵母菌株MY0-3 產乙酸乙酯的量為6.2 g/L。

2.5 固態發酵小試實驗

表8 產酯條件優化正交試驗結果

表9 正交試驗結果方差分析

制作MY0-3 麩曲應用于高粱固態發酵小試，對照組為鳳型大曲，實驗組為鳳型大曲+MY0-3 麩曲，固態發酵小試的基本理化指標見表10。發酵20 d 時，實驗組比對照組的乙酸乙酯含量高19.5%，發酵27 d 比對照組高17.8%。實驗組的乙酸乙酯含量隨發酵周期的延長而呈增加趨勢，酒精度在發酵后期略有下降。

表10 MY0-3固態發酵小試基本理化指標

3 結論

通過對實驗室現存酵母菌株及酒醅中分離酵母的篩選，共獲得具有高產乙酸乙酯特性的酵母菌株8 株，依次排序分別是MY0-3、MY5-9、B003、C3、B005、Y1、P6 和74。測定優選菌株的酒精、酸度及高糖耐受性，MY0-3 具有較低的酒精耐受性，最高耐受8%vol，最高耐受35 ℃；最高耐受3.0 酸度。通過正交試驗優化MY0-3 的產酯發酵條件，優化的發酵條件為pH3.5，酒精度2%vol，溫度25 ℃，發酵時間9 d，乙酸乙酯的產量為6.2 g/L。應用MY0-3 的固態發酵小試中，發酵20 d，乙酸乙酯含量實驗組比對照組高19.5%。