203 株耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌臨床分布特征及耐藥基因型分析

佘亞輝，韓媛媛，柴杰，榮令

碳青霉烯類抗菌藥物是治療由多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌引起的感染的有效藥物，尤其適用于產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和AmpCβ內(nèi)酰胺酶（AmpC酶）的病原菌引起的嚴(yán)重感染。然而，世界范圍的碳青霉烯類耐藥正挑戰(zhàn)著碳青霉烯類抗生素用于嚴(yán)重感染的治療［1-3］。耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（carbapenem resistant Enterobacteriaceae，CRE）的出現(xiàn)，引發(fā)了全世界的關(guān)注［4］。為了解醫(yī)院CRE 細(xì)菌的分布和耐藥情況，本研究通過對CRE菌株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用分子生物學(xué)方法檢測耐藥基因在CRE菌株中的表達(dá)，對CRE細(xì)菌分布及耐藥特點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)，為指導(dǎo)臨床合理選擇抗菌藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2016 年1 月至2018 年9 月亳州市人民醫(yī)院門診及住院病人分離的非重復(fù)耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌203 株，采用Vitek 2-Compact 全自動微生物分析儀進(jìn)行鑒定，金黃色葡萄球菌ATCC25923 和大腸埃希菌ATCC25922 為質(zhì)控菌株（本室保存）。因本研究主要涉及細(xì)菌學(xué)故免除了醫(yī)院倫理委員會的審查。

1.2 主要儀器和試劑 全自動微生物分析儀（法國梅里埃生物公司），DNA提取試劑盒（寶生物工程有限公司），實(shí)時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司），SYBR Green 熒光染料（美國ABI公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。參照文獻(xiàn)［5］設(shè)計(jì)引物，并由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，見表1。

表1 碳青霉烯酶耐藥基因PCR引物序列及產(chǎn)物長度

1.3 細(xì)菌鑒定和藥物敏感性試驗(yàn) 采用Vitek 2-Compact 全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)對細(xì)菌進(jìn)行鑒定及藥敏分析?？咕幬锇ǎ哼秽滓?、左氧氟沙星、頭孢唑林、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、厄他培南、頭孢替坦、頭孢他啶、氨芐西林、哌拉西林、妥布霉素、磺胺甲唑、丁胺卡那霉素、氨曲南、慶大霉素和氨芐西林/舒巴坦。以大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，結(jié)果判斷和分析參照2012 年CLSI 頒布的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。改良Hodge試驗(yàn)參照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行。

1.4 熒光定量PCR 擴(kuò)增碳青霉烯酶耐藥基因 采用DNA 提取試劑盒提取CRE 菌株基因組DNA，根據(jù)表1中的引物，采用SYBR Green 染料法進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 檢測碳青霉烯酶耐藥基因，配制20μL 反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR Master Mix 10μL，正向引物（10 μmol/L）1.0 μL，反向引物（10μmol/L）1.0μL，cDNA 2μL，ddH2O 6.0μL，總計(jì)20μL。反應(yīng)條件：94 ℃，10 min，1 個循環(huán)。94 ℃，15 s；60 ℃，60 s，共40 個循環(huán)。待擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)基線至適宜處，各熒光曲線與基線交叉點(diǎn)的循環(huán)數(shù)即為循環(huán)閾值（Cycle threshold，Ct），并調(diào)節(jié)閾值范圍判斷結(jié)果，以Ct值＜35判斷為陽性表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 CRE 細(xì)菌檢出率 從2016 年1 月至2018 年9月對我院分離出的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行耐藥分析，剔除同一病人同一部位分離的重復(fù)菌株，共發(fā)現(xiàn)203株對CRE亞胺培南或厄他培南耐藥的菌株，所有菌株均采用用改良Hodge試驗(yàn)進(jìn)行產(chǎn)碳青霉烯酶檢測驗(yàn)證。2016 年腸桿菌科分離的菌株數(shù)7 849 株，分離CRE菌46株，CRE菌檢出率為0.59%（46/7 849）；2017 年腸桿菌科分離的菌株數(shù)9 011 株，分離CRE菌84株，CRE菌檢出率為0.93%（84/9 011）；2018年1 至9 月腸桿菌科分離的菌株數(shù)5 473 株，分離CRE菌73 株，CRE 菌檢出率為1.33%（73/5 473）。2016年1 月至2018 年9 月CRE 菌總體檢出率為0.91%（203/22 333）。

2.2 CRE 菌株標(biāo)本來源分布情況及構(gòu)成比 203株耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌標(biāo)本來源不同臨床科室，以痰液標(biāo)本為主，占71.43%（145/203）；其次為中段尿液標(biāo)本，占14.78%（30/203）；第三為分泌物標(biāo)本，占5.42%（11/203），三者占總數(shù)的91.63%（186/203），見表2。

表2 耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌標(biāo)本來源分布情況及構(gòu)成比

2.3 CRE 細(xì)菌臨床科室分布情況 臨床科室分布以兒科為主，占30.05%（61/203）；其次是重癥監(jiān)護(hù)室，共分離出44 株，占21.67%（44/203）；泌尿外科、血液科、急診科和呼吸科分別占12.81%（26/203）、9.36%（19/203）、8.87%（18/203）和8.87%（18/203），其他科室共17株，占8.37%（17/203），具體見表3。

表3 耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌臨床科室分布情況及構(gòu)成比

2.4 CRE 細(xì)菌種類分布情況 在203 株CRE 菌株中，以肺炎克雷伯菌為主，占57.14%（116/203），其次大腸埃希菌，占25.62%（52/203），第三為產(chǎn)氣腸桿菌，占9.85%（20/203），具體見表4。

表4 耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌種類分布及構(gòu)成比

2.5 CRE 細(xì)菌藥物敏感性 203 株耐CRE 細(xì)菌對18種常用抗菌藥物的藥敏結(jié)果中，CRE耐藥率超過50.00%的抗菌藥物有12 種，占總數(shù)的66.7%；對大部分β 內(nèi)酰胺類藥物呈現(xiàn)高度耐藥，對亞胺培南的耐藥率達(dá)到100.00%，對厄他培南的耐藥率為82.27%；對頭孢唑林耐藥率為95.07%，對阿米卡星的敏感率最高，為77.34%；對第三代頭孢菌素（頭孢吡污，頭孢曲松和頭孢他啶）的普遍耐藥率均在75.00%以上，對環(huán)丙沙星和慶大霉素的敏感性較好，敏感率均在60.00%以上。見表5。

2.6 CRE 細(xì)菌耐碳青霉烯酶基因檢測 203 株CRE 菌株中NDM-1 基因擴(kuò)增陽性的菌株有78 株，占38.42%，KPC 基因陽性共有49 株，占24.14%；其中NDM-1 和HPC 同時陽性者19 例，占9.36%；IMP基因陽性共有56株，占27.59%；OXA-48基因陽性共有20 株，占9.85%；未擴(kuò)增出VIM 耐藥基因。見表6。

表5 203株耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌對常用抗菌藥物的藥敏率

表6 203株耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶基因檢測陽性率

3 討論

腸桿菌科細(xì)菌尤其是大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，是常見社區(qū)獲得性感染的病原菌。隨著腸桿菌科細(xì)菌中多重耐藥的急劇增多，由這些多重耐藥菌引起的感染性疾病治療的抗生素選擇受到了限制，而這正威脅著公眾的健康。

本研究結(jié)果顯示，2016 年1 月至2018 年9 月從我院住院病人分離CRE 菌203 株，CRE 菌總體檢出率為0.91%，高于東莞地區(qū)0.28%的CRE 檢出率［7］，同時我院每年CRE 的檢出率從呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢，給臨床治療帶來了極大的困難，應(yīng)引起充分重視。CRE 菌主要來自痰液標(biāo)本，占71.43%，大部分來源于重癥監(jiān)護(hù)室，這可能由于此類病人病情嚴(yán)重，多次進(jìn)行各種侵入性操作如氣管插管、插入呼吸機(jī)等，加上大量使用各類抗菌藥物，甚至濫用，造成病人免疫力低下，造成人體正常菌群破壞，增加了耐藥性CRE菌感染的機(jī)會。

CRE 細(xì)菌從科室分布來看主要來自兒科，占30.05%，這與周靜芳等［8］報(bào)道的結(jié)果一致，一方面可能是因?yàn)閮嚎剖俏以禾厣剖?，住院病人多，另一方面可能間接反映我院兒科用藥不規(guī)范，應(yīng)根據(jù)臨床藥敏結(jié)果合理用藥。CRE 細(xì)菌來自11 個不同的臨床科室，6種不同的臨床標(biāo)本，提示CRE細(xì)菌可引起多部位的感染。CRE 菌株中以肺炎克雷伯菌為主，占57.14%，與丁卉等［9］報(bào)道結(jié)果一致，提示臨床分離出肺炎克雷伯菌時應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果合理用藥。

藥敏結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，203 株CRE 菌對大多數(shù)抗菌藥物耐藥率較高，對頭孢唑林耐藥率為95.07%，在臨床治療時應(yīng)避免選用該類藥物。對阿米卡星的敏感率最高，為77.34%，可能是該類藥物具有較強(qiáng)耳毒性和腎毒性，臨床上該類藥物使用較少，耐藥發(fā)生少。鑒于其良好的敏感性，在安全情況下可優(yōu)先考慮使用該類藥物。對環(huán)丙沙星和慶大霉素的敏感性較好，敏感率均在60.0%以上。

碳青霉烯酶是一種能水解亞胺培南或美羅培南等抗菌藥物的β-內(nèi)酰胺酶，它包括A、B、D 三類酶，其中A 類為KPC 酶［10］，B 類為IMP 和VIM 金屬酶［11］，D類為OXA-48型酶［12］。2009年，一種新型的金屬β-內(nèi)酰胺酶，被命名為新德里-β-內(nèi)酰胺酶-1（NDM-1），從1 例印度裔瑞典男性尿路感染的病人尿液標(biāo)本中分離的肺炎克雷伯菌檢測出［13］。自從NDM-1的首次報(bào)道后，這一重要的碳青霉烯酶在多個國家的多種革蘭陰性桿菌中檢測出，代表了一新的挑戰(zhàn)向感染性疾病的治療［14-15］。研究表明，編碼碳青霉烯酶的基因通常和其他耐藥基因位于可移動的質(zhì)粒上，這便利了多重耐藥基因轉(zhuǎn)移至其他細(xì)菌［16］。本研究中采用熒光定量PCR 技術(shù)對CRE 菌株耐藥菌株基因型進(jìn)行檢測，比常規(guī)PCR和電泳相結(jié)合的方法更為方便，且結(jié)果容易判斷，適合大規(guī)模樣本檢測。CRE 菌株NDM-1 基因陽性的菌株有78 株，占38.42%，KPC 基 因 陽 性 共 有49 株，占24.14%，提示我院CRE 菌以NDM-1 和KPC 基因型為主，今后的研究工作應(yīng)對其同源性進(jìn)行分析，判斷有無院內(nèi)傳播流行。

綜上，我院CRE 菌耐藥較為嚴(yán)重，耐藥基因以NDM-1 和KPC 為主，臨床醫(yī)生應(yīng)加強(qiáng)耐藥監(jiān)測，合理選擇抗菌藥物，防止耐藥株在院內(nèi)傳播流行。