CDK1、CENPT和P53在乳腺癌中的表達(dá)及意義

趙若晗　史嘉翊　劉馨璥　宋潔

【摘要】 目的：研究CDK1、CENPT和P53在乳腺癌中的表達(dá)情況，探討基因表達(dá)與乳腺癌患者生存率及病理階段分型的關(guān)聯(lián)性和調(diào)控關(guān)系。方法：GEPIA數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌和正常樣本中的表達(dá)與總體生存率，乳腺癌患者基因表達(dá)與病理分期影響，CENPT與CDK1、BAX、BCL2、CASP3、P53的相關(guān)性分析，UALCAN數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證結(jié)果。敲減CENPT后，半定量PCR檢測(cè)CDK1、BAX、BCL2、CASP3、P53在MCF7細(xì)胞系中的表達(dá)。結(jié)果：CDK1、CENPT在乳腺癌及正常組織表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;CDK1、BCL2表達(dá)與不同病理分期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;P53不同表達(dá)乳腺癌患者總體生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;乳腺癌MCF7細(xì)胞系敲減CENPT后P53、BAX、CASP3表達(dá)量均減少（P<0.05）。結(jié)論：與正常組織比較，在乳腺癌中CENPT表達(dá)水平降低，CDK1表達(dá)水平升高;P53表達(dá)水平與生存率成反比。乳腺癌中CENPT、P53、Bax、CASP3信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡參與乳腺癌的進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌 生物信息學(xué) CENPT CDK1

Effect and Expression of CENPT， CDK1 and P53 in Breast Cancer/ZHAO Ruohan， SHI Jiayi， LIU Xinjing， SONG Jie. //Medical Innovation of China， 2020， 17（09）： 0-031

[Abstract] Objective： To discuss the expression of CENPT， CDK1 and P53 in breast cancer， to explore the correlation and the regulatory relationship between gene expression and survival rate and pathological stage classification of breast cancer patients. Method： GEPIA database was used to analyze the expression and overall survival rate of breast cancer and normal samples， the pathological stage and gene expression in breast cancer patients， the correlation between CENPT and CDK1， BAX， BCL2， CASP3， P53， and the validation results of UALCAN database. RT-PCR was used to detect the expression of CDK1， BAX， BCL2， CASP3 and P53 in MCF7 cell lines after knocking down CENPT. Result： The expression of CDK1 and CENPT in breast cancer and normal tissues were significantly different （P<0.05）. The expression of CDK1 and BCL2 was significantly different from those of different pathological stages （P<0.05）. The different expression of P53 was significantly different in the overall survival rate of breast cancer patients （P<0.05）. The expression of P53， BAX and CASP3 in breast cancer MCF7 cell lines decreased after CENPT knockout （P<0.05）. Conclusion： Compared with normal tissues， the expression level of CENPT in breast cancer is lower and the expression level of CDK1 is higher， and the expression level of P53 is inversely proportional to the survival rate. CENPT， P53， Bax， CASP3 signaling pathway regulates apoptosis in breast cancer and participates in the progression of breast cancer.

[Key words] Breast cancer Bioinformatics CDK1 CENPT

First-authors address： Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.09.007

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)發(fā)病率為16.8%，且每年3%～4%遞增[1]，文獻(xiàn)[2]證實(shí)細(xì)胞周期調(diào)控分子參與腫瘤進(jìn)程。Cyclin dependent kinase 1（CDK1）通過Centromere specafic proteins T（CENPT）調(diào)控動(dòng)粒核心蛋白網(wǎng)絡(luò)[3-4]。異常CDK1調(diào)控使細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[3]。磷酸化P53（tumor protein 53）誘導(dǎo)P21轉(zhuǎn)錄抑制CDK1活性。P53激活BCL2-Associated X（BAX）通路通過Caspase 3誘導(dǎo)凋亡[5]。CDK1、CENPT、P53與乳腺癌相關(guān)性未見報(bào)道，因此本文以三者為切入點(diǎn)探討它們?cè)谌橄侔┲械淖饔脵C(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 乳腺癌MCF-7細(xì)胞系由哈爾濱工業(yè)大學(xué)癌生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、PBS、RNA提取試劑、Taq Mix、引物均購(gòu)于生工生物有限公司，siRNA購(gòu)自銳博生物有限公司。

1.2 在線數(shù)據(jù)庫使用 GEPIA（gepia.cancer-pku.cn）進(jìn)生物信息學(xué)處理。對(duì)乳腺癌和正常樣本CENPT、CDK1、P53、BAX、BCL2、CASP3表達(dá)與患者病理分級(jí)、生存率及CENPT相關(guān)性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用UALCAN（ualcan.path.uab.edul）驗(yàn)證。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與siRNA轉(zhuǎn)染 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7，Count star計(jì)數(shù)5次平均值。細(xì)胞80%時(shí)按說明書轉(zhuǎn)染。

1.4 RT-PCR 檢測(cè)基因的表達(dá) 試劑盒提取cDNA，擴(kuò)增程序95 ℃ 5 min（95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s）×30次;72 ℃ 5 min，4 ℃保存。凝膠電泳分析條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。One-way ANOVA分析與乳腺癌患者病理分期相關(guān)性，Log-rank時(shí)序檢驗(yàn)分析乳腺癌患者總體生存率。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌與正常樣本中基因表達(dá)情況 GEPIA分析1 085例乳腺癌和291例正常樣本log2（TPM+1）對(duì)數(shù)比差異見圖1A。CENPT、CDK1差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 031、0.000 004），CDK1、P53、BAX、BCL2、CASP3在乳腺癌中均高表達(dá)，CENPT與其他表達(dá)趨勢(shì)相反。UALCAN趨勢(shì)一致見圖1B。

2.2 乳腺癌患者病理分期與表達(dá)分析 乳腺癌樣本F分布>3，log2（TPM+1）對(duì)數(shù)假設(shè)檢驗(yàn)P值單向病理階段差異分析，Pr（>F）<0.05為顯著，見圖2。CDK1、BCL2表達(dá)對(duì)不同病理分期患者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.17、3.2，P=0.000、0.012 6），BCL2表達(dá)隨病理分期進(jìn)展而降低，CDK1一期到二期上升。

2.3 乳腺癌患者總體生存率時(shí)序檢驗(yàn)與表達(dá)分

析 GEPIA分析乳腺癌患者基因表達(dá)與生存率，Cox PH計(jì)算危險(xiǎn)比見圖3A、3B。同一時(shí)間低表達(dá)P53（HR=1.4，P=0.038）存活人數(shù)高于高表達(dá)，隨著時(shí)間推進(jìn)差異更明顯。其他相關(guān)基因表達(dá)水平對(duì)乳腺癌患者的總體生存率影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與UALCAN趨勢(shì)一致見圖3C。P53高表達(dá)人群總體生存率危險(xiǎn)比最高生存力最低，依次為CDK1、CASP3、BCL2、CENPT、BAX。

2.4 CENPT與CDK1、P53、BAX、BCL2、CASP3相關(guān)性分析 GEPIA分析基因表達(dá)相關(guān)性，PEARSON對(duì)數(shù)可視化，|R|=1相關(guān)性最強(qiáng)。CENPT與CASP3（P=5.2×10-54，R=-0.4）、CDK1（P=1.8×10-27，R=-0.29）、P53（P=8.5×10-21，

R=-0.25）相關(guān)性較強(qiáng)，與BCL2（P=3.7×10-13，R=-0.19）、

BAX（P=3.3×10-9，R=-0.16）較弱見圖4A。半定量PCR分析，CENPT敲減前為（0.143±0.008），敲減后為（0.011±0.001），敲減前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.900，P=0.000）;MCF7中P53、CASP3、BAX分別由（0.053±0.003）、（0.068±0.004）、（0.043±0.002）減少至（0.009±0.001）、（0.028±0.002）、（0.022±0.001），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.099、9.373、7.623，P=0.000、0.002、0.002）;CDK1、BCL2表達(dá)變化比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）見圖4B、C。

3 討論

細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡與腫瘤密切相關(guān)。遺傳物質(zhì)的不平衡是腫瘤進(jìn)展的重要特征。染色體不穩(wěn)定性產(chǎn)生主要涉及染色體的著絲粒、監(jiān)測(cè)點(diǎn)等原因[6]。因此，著絲粒結(jié)構(gòu)和功能的研究是探討腫瘤細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的切入點(diǎn)[7]。

本文分析探討低表達(dá)CENPT與乳腺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系。數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌和正常樣本CENPT、CDK1、BAX、BCL2、P53、CASP3表達(dá)，CENPT在

乳腺癌表達(dá)水平低于正常樣本，與其他相反，其中CDK1最顯著。CENPT與CASP3、CDK1、P53的相關(guān)性比BCL2、BAX強(qiáng)。P53對(duì)患者的總體生存率影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），成反比。敲低CENPT后P53、CASP3、BAL2表達(dá)量均減少（P<0.05），CDK1、BCL2差異均不顯著（P>0.05）。CENPT調(diào)控CDK1周期動(dòng)粒蛋白網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。雖然敲低CENPT后CDK1在轉(zhuǎn)錄水平變化不明顯，但可能磷酸化的CDK1會(huì)引發(fā)細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，同時(shí)P53可被CDK1-Cyclin復(fù)合物磷酸化誘導(dǎo)P21轉(zhuǎn)錄，P21抑制CDK1活性[8]，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。敲減CENPT后P53、BAX、CASP3表達(dá)量均減少，可能因?yàn)榧?xì)胞凋亡是由基因控制細(xì)胞的主動(dòng)自主有序死亡，涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控作用[9-10]。P53異常抑制抗凋亡因子BCL2，且BAX被P53轉(zhuǎn)錄激活導(dǎo)致P53成功誘導(dǎo)凋亡[11-12]。凋亡小體前提活化胱天蛋白酶家族CASP3參與凋亡執(zhí)行、降解多種底物導(dǎo)致，E2F誘導(dǎo)BCL2促凋亡蛋白表達(dá)，P53突變功能喪失，凋亡小體活化，BAX突變失活BCL2表達(dá)失調(diào)[13-15]。CASP3能被P53及外界刺激細(xì)胞信號(hào)活化，釋放BAX等促凋亡蛋白[16]，增強(qiáng)癌細(xì)胞控凋亡途徑。

綜上所述，乳腺癌中CENPT表達(dá)下調(diào)抑制P53，從而抑制BAX、CASP3凋亡通路參與乳腺癌進(jìn)展。CENPT是否抑制P53下調(diào)P21、激活CDK1活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Benson J R，Jatoi I，Keisch M，et al.Eaely breast cancer[J].Lancet，2009，373（9673）：1463-1479.

[2] Lumachi F，Santeufemia D A， Basso S M.Current medical treatment of estrogen receptor positive breast cancer[J].World J Biol Chem，2015，6（3）：231-239.

[3]李麗，李雪婷，張振華，等.食管癌變過程中CyclinB1＼CDK1及細(xì)胞周期調(diào)控因子p53、Rb的表達(dá)及意義[J].世界華人消化雜志，2015，23（31）：4968-4974.

[4]王曉雪，劉佳奇，趙若晗，等.CENPC CENPT在乳腺癌中的表達(dá)及意義[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2019，40（2）：13-15.

[5]劉儒，謝基明，孟峻.細(xì)胞分裂周期蛋白14生物學(xué)功能的研究進(jìn)展[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2019，45（4）：960-964.

[6]柯抒晨，林義，陳利瓊，等.萊菔硫烷調(diào)控RhoA/ROCK信號(hào)通路誘導(dǎo)宮頸鱗癌細(xì)胞凋亡[J].中國(guó)新藥與臨床雜志，2019，38（6）：362-366.

[7]馬蘭，王思恒，吳瓊，等.KCTD5對(duì)急性單核細(xì)胞白血病U937細(xì)胞增殖的影響[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2019，41（5）：859-866.

[8]趙文昭，王英杰，張冠醫(yī)，等.番茄紅素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響[J].西部中醫(yī)藥，2019，32（7）：29-33.

[9]卜培龍.基于TCGA肝細(xì)胞癌相關(guān)基因篩選及CDK1mRNA表達(dá)預(yù)后研究[D].鄭州：河南大學(xué)，2019.

[10]劉冰.去泛素化酶USP14調(diào)控CDK1在乳腺癌中作用及分子機(jī)制研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2019.

[11]張瑞濤，史惠蓉，任芳，等.G2/M期P53/CDK1通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，53（4）：502-508.

[12]馮立文，虞飛，李姝，等.P53、P21（WAF-1）和CDK1在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義[J].診斷病理學(xué)雜志，2019，26（8）：516-518.

[13]張瑞濤.P53、P21-WAF1和CDK1在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及其意義[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2009.

[14]史惠蓉，張瑞濤.P53，P21-WAF1和CDK1在卵巢癌組織表達(dá)[J].癌癥，2009，28（8）：882-885.

[15]張明君，舒申友，周鏡桂，等.探究增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中CDK4、CDK2、CDK1基因與細(xì)胞周期的相關(guān)性[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015，12（9）：4-6.

[16]李軍擴(kuò)，楊海軍，張靜芳.Ki-67和p53在三陰乳腺癌中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2016，13（2）：12-14.

（收稿日期：2019-10-30） （本文編輯：程旭然）

*基金項(xiàng)目：黑龍江省省屬高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（2018-kyywfmy-0030）;牡丹江醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2018YJSCX-33MY）