比濁法測定硫酸多黏菌素抑制霉菌的條件優化

王志新,宏丹,魯雷震,周景波,劉洋,寧亞維,馬愛進,賈英民

1(河北科技大學 生物科學與工程學院，河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊,050018) 2(北京工商大學 食品與健康學院，北京,100048)

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是指具有抑菌活性的小分子多肽，可以抑制多種病原微生物[1-3]。種類多、抑菌譜廣、抑菌活性高、無污染、無殘留是抗菌肽的顯著優勢[4]。現今抗菌肽已廣泛應用于農業[5]、養殖業[6, 4, 11-12]、食品工業[7-10]、醫藥行業[13]等領域。近年來，抗菌肽替代抗生素的研究已成為人們關注的熱點。目前，抗菌肽已被廣泛開發與使用，常見抑制革蘭氏陽性菌的肽有桿菌肽，抑制革蘭氏陰性菌的肽有多黏菌素B、黏菌素等[14]，抑制真菌的肽有沙拉霉素、硫酸多黏菌素等[15]，用于食品保藏劑的有乳鏈菌肽[16-18]，用于飼料添加劑的有硫肽菌素、那西肽等[19]。

食品在加工、包裝和儲運過程中與外界環境接觸，使得食品帶有種類繁多的微生物，其中霉菌生長力旺盛、抵抗力強，食品中豐富的營養物質加速霉菌的繁殖，最終引起食品腐爛變質。部分霉菌在侵染食品的過程中還會產生有毒物質，因此，防治霉菌污染已成為食品保藏中的重要研究內容。在霉菌污染的防治中，生物防腐劑或抑菌劑已被廣泛開發與應用。龔慶偉[20]研究發現，芽孢桿菌脂肽Bacillomycin D對黃曲霉病菌孢子的最小抑菌質量濃度為0.05 g/L，最小致死質量濃度為0.2 g/L。韓玉竹等[21]報道辣椒籽抗菌肽能夠抑制黃曲霉生長，在最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)下，黃曲霉的萌發率降至18.51%，濃度達到4MIC時能完全抑制黃曲霉孢子的萌發。但目前在抗菌肽抑制腐敗霉菌的研究存在一定問題，即測定方法和評價指標不統一，致使測定結果可比性差。因此，尋找一種簡單、準確、快速的評價方法成為抗菌肽研究與開發的關鍵。

目前關于抗菌肽抑制真菌的活性檢測方法主要有瓊脂擴散法[22]、菌絲生長抑制法[23]和孢子萌發抑制法[24]。本實驗室前期采用瓊脂擴散法測定了抗菌肽抑制真菌[15]和細菌[25]的活性，顯示方法準確，但所需試驗時間較長(一般需要30～34 h)；而采用菌絲生長抑制法和孢子萌發抑制法測定對真菌的抑菌活性時容易產生試驗誤差。因此，尋找簡單、準確、快速測定抗菌肽對真菌抑菌活性的方法尤為重要。目前對于抗菌肽的測定一般參照中國藥典[26]中抗生素的測定方法，其主要采用微生物檢定法，其中的比濁法是通過建立抗生素濃度對數值與吸光度的線性關系來測定抗生素對細菌和酵母菌的抑菌活力[26]，很多文獻也有相關報道[27-29]。該方法操作簡單、結果相對準確快速，但此方法在中國藥典中并未涉及對真菌的檢測。由于真菌具有菌絲，這種測定方法是否適用于抗菌肽對真菌的抑菌活性檢測，還有待于研究。

基于此，本文采用比濁法，以硫酸多黏菌素B和青霉為研究對象，考察此法是否適合評價抗菌肽對霉菌的抑菌活性；同時對影響比濁法測定的關鍵因素進行優化，建立抗菌肽濃度對數值與吸光度的線性關系，利用線性相關系數R2、斜率、截距等優化指示菌濃度、抗菌肽濃度、二者比例和兩者反應時間等因素，并進一步選用常見的引起食品腐敗的霉菌典型代表——黑曲霉、黃曲霉、總狀毛霉進行驗證，以期獲得簡單、準確、快速的測定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

產黃青霉(Penicilliumchrysogenum)ATCC 10106、黑曲霉(Aspergillusniger)ATCC 16404、黃曲霉(Aspergillusflavus)ATCC 9643、總狀毛霉(Mucorracemosus)ATCC 23314，本實驗室保存。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基(PDB)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)，北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.3 抗菌肽

硫酸多黏菌素 B(polymyxin B)，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器設備

ZHJH-C1109C超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；ZSD-A1160全自動新型生化培養箱，上海智城分析儀器制造有限公司；EVOLUTION 220紫外分光光度計，天美科學儀器有限公司；OLYMPUS-CX31顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社；SHZ-A水浴恒溫振蕩器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 孢子懸液的配制

將產黃青霉均勻涂布于PDA培養基，28 ℃恒溫靜置培養18～24 h，取適量生理鹽水加入培養基表面，用涂布棒在培養基表面輕輕刮動，脫脂棉過濾菌絲，獲得孢子懸液，血球計數板進行計數，采用生理鹽水對孢子懸液進行稀釋和調整，備用。

1.3.2 硫酸多黏菌素溶液的配制

選用無菌水配制硫酸多黏菌素，質量濃度為0.01～5.0 g/L，備用。

1.3.3 指示菌培養方式的選擇

將1.3.1制備的孢子懸液添加到PDB培養基中，保證兩者的指示菌初始添加濃度相同，選擇靜置與振蕩2種培養方式，每隔2 h采用紫外分光光度計測定吸光度(OD600)，觀察2種培養方式對指示菌生長的影響。

1.3.4 硫酸多黏菌素濃度與吸光度的線性關系

指示菌濃度為(1～2)×106CFU/mL，硫酸多黏菌素質量濃度選擇0.01～2.5 g/L(終質量濃度為0.01～0.5 g/L)，指示菌與硫酸多黏菌素比例為4∶1，振蕩培養10 h后觀察其生長情況，并測定OD600值。將硫酸多黏菌素質量濃度對數值設為橫坐標，吸光度OD600值設為縱坐標，分析兩者是否成線性關系。

1.3.5 定量測定方法的優化

1.3.5.1 硫酸多黏菌素濃度的選擇

指示菌濃度為(1～2)×106CFU/mL，硫酸多黏菌素質量濃度為0.01～2.5 g/L(終質量濃度0.01～0.5 g/L)，指示菌與硫酸多黏菌素比例為4∶1，振蕩培養10 h，觀察其生長情況并測定OD600值。

1.3.5.2 指示菌濃度的選擇

選擇產黃青霉濃度為(1～2)×105、(1～2)×106和(1～2)×107CFU/mL，硫酸多黏菌素質量濃度選擇0.01～2.5 g/L(終質量濃度0.01～0.5 g/L)，指示菌與硫酸多黏菌素比例為4∶1，振蕩培養10 h，觀察其生長情況并測定OD600值。并進一步采用(3～5)×106CFU/mL的指示菌，進行驗證。

1.3.5.3 指示菌與硫酸多黏菌素比例的選擇

保證不同比例下硫酸多黏菌素質量濃度為0.01～2.5 g/L(終質量濃度0.01～0.5 g/L)和指示菌終濃度為(1～2)×106CFU/mL，通過調節二者的初始濃度，將指示菌與硫酸多黏菌素濃度比例分別設為1∶1、4∶1和9∶1，培養10 h后觀察其生長情況并測定OD600值的變化。

1.3.5.4 反應時間的選擇

指示菌濃度為(1～2)×106CFU/mL，硫酸多黏菌素質量濃度選擇為0.01～2.5 g/L(終質量濃度0.01～0.5 g/L)，指示菌與硫酸多黏菌素比例為4∶1，分別振蕩培養7、8、9、10、11 h，觀察其生長情況并測定OD600值。

1.3.6 驗證試驗

不同實驗人員的驗證：另外3名實驗人員按照優化后的測定條件進行方法穩定性的驗證。

不同指示菌的驗證：選用黑曲霉ATCC 16404、黃曲霉ATCC 9643和總狀毛霉ATCC 23314為指示菌進行方法通用性的驗證。

2 結果與分析

2.1 指示菌培養方式的選擇

霉菌生長較為緩慢，不同培養方式對霉菌的生長具有顯著影響，本試驗選擇振蕩與靜置2種培養方式。從圖1可以看出，0～3 h產黃青霉濃度呈現下降趨勢，初步推斷在加入硫酸多黏菌素后將部分產黃青霉殺死。振蕩培養3 h開始，青霉開始生長，濃度呈現上升趨勢；培養到12 h以后，吸光度呈現下降趨勢，根據實驗實際情況觀察，此時青霉菌絲生長明顯，菌絲相互纏繞，影響吸光度的測定，導致OD下降。靜置培養3 h開始，青霉濃度呈現上升趨勢，但OD600值相對于振蕩培養增長緩慢，培養到15 h以后，吸光度呈現下降趨勢，此時青霉菌絲生長明顯，導致OD600值下降。為了節省試驗時間，提高效率，本試驗選擇振蕩培養進行抑菌活性的研究。

圖1 靜置培養與振蕩培養的比較

2.2 硫酸多黏菌素濃度對數值與指示菌吸光度值線性關系的驗證

從圖2看出，硫酸多黏菌素在0.01～2.5 g/L(終質量濃度0.01～0.5 g/L)范圍內，比濁法測定硫酸多黏菌素的濃度對數值與吸光度值呈現線性關系。

圖2 硫酸多黏菌素濃度對數值與吸光度之間的線性關系

由表1可知，3次重復試驗，斜率截距的相對偏差均較小，且相關系數R2均高于0.99，說明此方法測定結果的準確性和精密度較高，且重復性較好。

表1 硫酸多黏菌素濃度對數值與吸光度線性關系的結果分析

2.3 硫酸多黏菌素定量測定方法的優化

在試驗過程中，硫酸多黏菌素濃度、指示菌濃度、兩者的比例和培養時間等因素均會對試驗測定產生影響，因此，下一步需要對以上因素進行優化，以期獲得最適的定量測定條件。

2.3.1 硫酸多黏菌素濃度的選擇

采用0.01～2.5 g/L(終質量濃度0.01～0.5 g/L)的硫酸多黏菌素質量濃度進行研究，其結果見圖3和表2。硫酸多黏菌素質量濃度在0.01～2.5 g/L(終質量濃度0.01～0.5 g/L)范圍內呈現良好的線性關系，3次重復的R2均大于0.99，根據斜率和截距可知，該試驗的精密度和穩定性較好。

圖3 硫酸多黏菌素濃度的選擇

表2 不同硫酸多黏菌素濃度結果分析

2.3.2 青霉濃度的選擇

根據實際情況和表3的結果可知，培養10 h后，產黃青霉濃度為(1～2)×105CFU/mL時，菌體生長不明顯，不能很好地表征硫酸多黏菌素的抑菌效力，且導致試驗誤差大，在一定的硫酸多黏菌素濃度范圍內不能呈現線性關系。青霉濃度為(1～2)×107CFU/mL時菌體濃度高，菌體量大，生長旺盛，培養10 h后出現菌絲纏繞現象，影響吸光度值，誤差較大(圖4)。青霉濃度為(1～2)×106CFU/mL時，在特定的硫酸多黏菌素濃度范圍內呈現良好的線性關系且重復性較好(圖5和表3)。

表3 不同指示菌濃度結果分析

圖4 產黃青霉濃度為(1～2)×107 CFU/mL的生長情況

圖5 產黃青霉濃度為(1～2)×106 CFU/mL的試驗結果

進一步采用(3～5)×106CFU/mL濃度的青霉進行驗證，從圖6和表4可以看出，線性關系良好，根據斜率和截距得出，青霉濃度為(1～2)×106和(3～5)×106CFU/mL時，試驗的精密度和穩定性都很高，因此，青霉濃度選擇(1～5)×106CFU/mL。

圖6 產黃青霉濃度為(3～5)×106 CFU/mL的試驗結果

表4 產黃青霉濃度(3～5)×106 CFU/mL驗證試驗

2.3.3 指示菌和硫酸多黏菌素比例的選擇

指示菌與硫酸多黏菌素濃度比例分別設為1∶1、4∶1和9∶1，從圖7和表5看出，指示菌與硫酸多黏菌素濃度比例為1∶1和9∶1時線性相關差，且比例為1∶1時，體系中培養基量較少,不能為菌體的生長提供足夠的營養物質；比例為9∶1時，菌體生長較快，不能很好地表征硫酸多黏菌素的抑菌效力；而當兩者比例為4∶1時，培養基適中，線性相關性較好，斜率和截距相對偏差較小，此時精密度和穩定性好，因此本試驗選擇指示菌和硫酸多黏菌素的比例為4∶1。

圖7 指示菌和硫酸多黏菌素比例的選擇

表5 指示菌和硫酸多黏菌素不同比例的試驗結果分析

2.3.4 反應時間的選擇

不同反應時間的結果見圖8和表6。培養7和8 h后指示菌菌體量少，結果誤差較大，硫酸多黏菌素濃度對數值與吸光度線性關系較低，斜率和截距相對偏差較大。隨著培養時間的延長，11 h時青霉已長出菌絲，出現菌絲纏繞現象，測定結果不穩定。而培養時間為9 h時，基本還未出現菌絲，且線性相關性較強(R2>0.99)，根據斜率和截距可以看出，精密度和穩定性也較好，因此，本試驗選擇反應時間為9 h。

圖8 指示菌和硫酸多黏菌素反應時間選擇

表6 指示菌和硫酸多黏菌素反應不同時間試驗結果分析

2.4 驗證實驗

利用優化后的條件：指示菌濃度(1～5)×106CFU/mL，硫酸多黏菌素質量濃度0.01～2.5 g/L(終質量濃度0.01～0.5 g/L)，二者比例4∶1，反應時間9 h，進一步驗證方法的準確性和通用性。

通過不同人員的操作研究方法的準確性，實驗結果如圖9和表7。結果顯示，硫酸多黏菌素濃度對數值與吸光度之間呈現良好的線性關系(R2>0.99)，從斜率和截距可以看出，本實驗的精密度和穩定性較好。

圖9 硫酸多黏菌素抑制P.chrysogenum ATCC 10106的驗證實驗

表7 硫酸多黏菌素抑制P.chrysogenum ATCC 10106的驗證實驗結果分析

進一步選用黑曲霉、黃曲霉和總狀毛霉為指示菌，利用優化后的條件進行方法通用性的驗證。從圖10、11、12和表8、9、10看出，硫酸多黏菌素濃度對數值與吸光度成線性關系，斜率和截距相對偏差較小，說明試驗精密度高，穩定性好。

圖10 硫酸多黏菌素抑制A.niger ATCC 16404的驗證實驗

表8 硫酸多黏菌素抑制A.niger ATCC 16404的驗證實驗結果分析

圖11 硫酸多黏菌素抑制A.flavus ATCC 9643的驗證實驗

表9 硫酸多黏菌素抑制A.flavus ATCC 9643的驗證實驗結果分析

圖12 硫酸多黏菌素抑制M.racemosus ATCC 23314的驗證實驗

表10 硫酸多黏菌素抑制M.racemosus ATCC 23314的驗證實驗結果分析

通過上述驗證試驗進一步說明，利用比濁法研究硫酸多黏菌素對霉菌的定量測定，該方法具有廣泛適用性，且測定簡單、準確、快速。

3 結論

本研究選用比濁法，通過優化指示菌濃度、硫酸多黏菌素濃度、二者的比例以及反應時間等因素，建立了硫酸多黏菌素抑制霉菌的定量測定方法，其最佳條件為：指示菌濃度(1～5)×106CFU/mL，硫酸多黏菌素質量濃度0.01～2.5 g/L(終質量濃度0.01～0.5 g/L)，二者比例4∶1，反應時間9 h，在600 nm波長下測定吸光度，硫酸多黏菌素濃度對數值與吸光度之間呈現線性關系，選用黑曲霉、黃曲霉和總狀毛霉作為指示菌進一步驗證，結果顯示，比濁法的重復性高。

本實驗室前期采用瓊脂擴散法[15]研究多黏菌素抑制霉菌的測定方法，顯示其進行抑菌活力測定時需要30～34 h(4 ℃冰箱預擴散6～10 h，28 ℃培養箱培養18～24 h)，而本研究采用的比濁法僅需要9 h即可完成測定，時間縮短了21～25 h，解決了瓊脂擴散法測定抗菌肽效價時間長的問題。由此可以表明，比濁法測定硫酸多黏菌素抑制霉菌活性的方法具有簡單、準確、快速的特點。