海洋細菌Vibrio fluvialis的分離鑒定、產瓊膠酶條件優化及酶的分離純化

李馳，李春生，楊賢慶*，戚 勃，趙永強，王悅齊

1(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島,266000) 2(中國水產科學研究院南海水產研究所，農業農村部水產品加工重點實驗室，廣東 廣州,510300)

瓊膠又稱瓊脂，在食品中作為膠凝劑、增稠劑和穩定劑被廣泛應用[1]。瓊膠主要存在于龍須菜、石花菜、江蘺等紅藻體內，由瓊脂糖和硫瓊膠組成[2]。瓊脂糖是由(l→3)-O-β-D-半乳糖和(1→4)-O-3, 6內醚-α-L-半乳糖交替組成的瓊二糖重復單位連接而成，而硫瓊膠的結構較為復雜，由硫基丙酮酸、D-半乳糖、半乳糖醛酸等組成[3]。

瓊膠寡糖主要由瓊膠水解產生，研究表明其具有良好的抗氧化、抗病毒等活性，在食品與醫藥領域有著廣泛的應用前景[4]。目前在工業上瓊膠寡糖一般使用酸解法生產，但是該方法存在產物均一性差、產物回收難、反應條件不易控制等問題，嚴重制約了對其開發和利用。瓊膠酶是一類能夠降解瓊膠的酶，根據其作用方式不同可以分為α-瓊膠酶和β-瓊膠酶2類。α-瓊膠酶能夠裂解瓊脂糖的α-1,3糖苷鍵，生成以3,6-內醚-半乳糖為還原性末端的瓊寡糖，而β-瓊膠酶能夠裂解瓊脂糖的β-1,4糖苷鍵，生成以β-D-半乳糖為還原性末端的新瓊寡糖[5]。目前發現的瓊膠酶大部分為β-瓊膠酶。與酸解法相比，酶解法具有寡糖得率高、產物均一性好等優點。除了可用于制備瓊膠寡糖，瓊膠酶還可以用于瓊脂糖凝膠電泳后DNA的回收[6]、海藻多糖結構分析[7]、紅藻原生質體制備[8]等方面。因此，瓊膠酶具有十分重要的研究價值。

瓊膠酶主要存在于以瓊膠為碳源的微生物體內，這些微生物大多來源于富含瓊膠的海藻表面和以海藻為食的海洋軟體動物消化道內。現階段，絕大多數被分離研究的瓊膠酶都是來自海洋微生物，主要包括弧菌屬(Vibriosp.)[9]、噬瓊膠菌屬(Agarivoranssp.)[10]、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)[11]、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)[12]、不動桿菌屬(Acinetobactersp.)[13]和海水桿菌屬(Aquimarinasp.)[14]等。目前已有不少產瓊膠酶菌株被分離出來，但由于酶活力低、產酶性狀不穩定等因素限制，導致瓊膠酶難以工業化生產。

本研究從龍須菜表面分離得到了1株具有高瓊膠酶活力的菌株A8，采用VITEK 2 GN微生物鑒定系統和16S rRNA基因序列分析對其進行鑒定；利用培養基成分和培養條件優化，確定了該菌株的最佳產酶條件；通過(NH4)2SO4沉淀、離子交換層析等技術對菌株分泌的瓊膠酶進行純化，并利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝膠電泳確定瓊膠酶的分子質量。為瓊膠酶生產菌株的篩選和應用提供重要技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

菌株A8分離自腐爛的龍須菜表面。

1.1.2 培養基

(1)平板和斜面保藏培養基(g): 瓊脂20，NaCl 10，胰蛋白胨10，酵母浸粉5，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.5。

(2)液體種子培養基(g): NaCl 10，胰蛋白胨10，酵母浸粉5，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.5。

(3)發酵培養基(g): 瓊脂2，酵母浸粉4，人工海水1 000 mL[15]，pH 7.0。

以上培養基均經過121 ℃，15 min高壓蒸汽滅菌; 發酵培養基(50 mL)分裝至250 mL錐形瓶內。

1.1.3 主要試劑

瓊脂粉和酵母浸粉，廣東環凱微生物科技有限公司；DEAE Sepharse FF，合肥博美生物科技有限公司。DNS試劑配制參考文獻[16]。

1.2 主要儀器與設備

全自動細菌鑒定儀，法國Bio Mérieux公司；SQ510C立式壓力蒸汽滅菌鍋，日本YAMATO；臺式高速冷凍離心機，德國Sigma公司；低溫恒溫培養箱，日本三洋公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 產瓊膠酶菌株的分離純化

稱取5 g腐爛龍須菜到50 mL無菌水中，搖勻。將稀釋10-1～10-6六個濃度梯度的菌懸液分別涂布在LB平板培養基中，37 ℃培養2 d，選取凹陷較大的菌落接種到新的平板中，37 ℃培養2 d后用魯戈氏碘液染色，挑取透明圈最大的菌落，多次劃線，最終篩選出具有高瓊膠酶活力的菌株A8，保存于斜面培養基中。

1.3.2 菌株A8的生理生化鑒定

將斜面保藏的菌株劃線接種到新鮮斜面培養基上，37 ℃培養20 h收集菌體，用4.5 g/L的NaCl溶液稀釋至比濁度為0.5～0.63 MCF，將配制好的菌液和革蘭氏陰性菌鑒定卡放入全自動細菌鑒定儀，用VITEK2 GN微生物鑒定系統對菌株進行鑒定。

1.3.3 16S rRNA基因序列分析

菌株A8的16S rRNA基因測序由北京六合華大基因科技有限公司完成。將測得的16S rRNA基因序列在NCBI上進行比對分析。選擇同一屬內序列相似標準菌株的16S rRNA基因序列，使用Clustal W進行多序列對比。使用MEGA 5.1進行系統發生分析，采用最大似然法構建系統進化樹[17]。

1.3.4 發酵條件優化

除特別說明外，培養溫度為37 ℃，轉速為180 r/min，培養時間為24 h，接種量為2%(體積分數，下同)，250 mL錐形瓶裝液量為50 mL，測定發酵液中瓊膠酶的活力，以確定最佳的發酵條件，每次優化的結果都用于之后的實驗。

1.3.4.1 碳源

分別以2 g/L瓊膠、2 g/L葡萄糖、2 g/L蔗糖、2 g/L半乳糖、2 g/L瓊膠+2 g/L葡萄糖、2 g/L 瓊膠+2 g/L 蔗糖、2 g/L瓊膠+2 g/L半乳糖作為培養基的唯一碳源，其他成分同發酵培養基，以確定最佳的碳源種類。然后改變培養基中最佳碳源的質量濃度(0、1、2、3、4、5 g/L)，以確定最佳碳源的質量濃度。

1.3.4.2 氮源

分別以2 g/L蛋白胨、2 g/L酵母浸粉、2 g/L(NH4)2SO4、2 g/L NH4NO3、2 g/L NH4Cl、2 g/L酵母浸粉+2 g/L NH4Cl作為培養基的唯一氮源，以確定最佳的氮源種類。然后改變培養基中最佳氮源的質量濃度(1、2、3、4、5 g/L)，以確定最佳的氮源質量濃度。

1.3.4.3 NaCl質量濃度

在培養基中添加不同質量濃度的NaCl(0、5、10、15、20、25 g/L)，以確定培養基中最佳的NaCl質量濃度。

1.3.4.4 接種量

以最適產酶培養基為基礎，將菌液分別按照體積分數為1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量進行接種，以確定菌株A8最佳的接種量。

1.3.4.5 初始pH

分別調節產酶培養基的初始pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以確定菌株的最適初始pH。

1.3.4.6 培養溫度

設置不同培養溫度(15、20、25、30、37、40 ℃)進行培養，以確定菌株的最適培養溫度。

1.3.4.7 正交實驗

在單因素試驗結果的基礎上，選擇3個影響最大的因素進行正交試驗。在180 r/min轉速下培養24 h，然后測定發酵液中瓊膠酶的活力，以獲得菌株A8發酵產酶的最佳條件。

1.3.5 菌株生長對其產酶影響

將菌株接種于種子培養基中，在最適條件下培養24 h，以最適接種量接種于優化后的發酵培養基中，每隔一段時間取一次樣，于600 nm處測其吸光度，并測發酵培養基上清液的酶活力，利用Pearson相關性分析研究菌株生長對其產瓊膠酶的影響。

1.3.6 酶的分離純化

1.3.6.1 (NH4)2SO4沉淀

菌株A8的發酵液在8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，分別在上清液中加入(NH4)2SO4至0%～80%飽和度，4 ℃靜置2 h，10 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，用pH 7.0磷酸緩沖液溶解沉淀后放入透析袋內透析除去(NH4)2SO4，然后測定不同飽和度透析液的瓊膠酶活力和蛋白含量，以確定(NH4)2SO4沉淀的最佳飽和度范圍，然后采用(NH4)2SO4分級沉淀方法對瓊膠酶進行粗分離。

1.3.6.2 DEAE陰離子交換層析

將透析所得粗酶液用PEG-20000濃縮，然后經0.22 μm微孔濾膜過濾后上樣于DEAE陰離子交換柱，用0.3 mol/L的NaCl溶液洗脫，流速控制為1.5 mL/min，得到純化后的酶液。

1.3.6.3 SDS-PAGE凝膠電泳[7]

SDS-PAGE凝膠電泳由12%的分離膠和8%的濃縮膠組成，蛋白質的染色與脫色均采用常規考馬斯亮藍染色法和脫色技術。

1.3.7 瓊膠酶活力測定

將2 mL 2 g/L的瓊膠溶液加入25 mL比色管中，40 ℃預熱10 min，加入0.1 mL酶液，混勻后于40 ℃反應30 min，用沸水浴滅活5 min的酶液加底物作為空白對照，加入2 mL DNS試劑，于沸水浴中反應5 min，冷卻后定容至25 mL，測520 nm處的吸光值。以每分鐘產生1 μg還原糖的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.3.8 統計分析

每個實驗都設置3組重復，使用SPSS 20軟件對實驗數據進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，使用多重比較Tukey對每個實驗組數據之間的差異性進行檢驗，每個圖中數據之間無相同的字母即為差異顯著，P<0.05。

2 結果與分析

2.1 產酶菌株的鑒定

革蘭氏染色結果顯示，A8為革蘭氏陰性菌。采用VITEK 2 GN微生物鑒定系統分析結果如表1所示，菌株A8與V.fluvialis的可能性百分率為90%，因此初步確定菌株A8屬于弧菌屬(Vibrio)。進一步，將菌株A8的16S rRNA基因序列在NCBI比對后發現，其與多種弧菌屬的菌株相似度較高。選擇與菌株A8序列相近的弧菌屬標準菌株的16S rRNA基因序列，構建系統進化樹。經計算，菌株A8的16S rRNA基因序列與V.fluvialisNBRC103150的距離最近，二者同源性為99.38%。綜合生理生化和分子生物學鑒定結果，最終確定該菌為Vibriofluvialis。因此，將產瓊膠酶海洋菌株A8重新命名為VibriofluvialisA8。本研究也是首次報道Vibriofluvialis具有瓊膠酶活力。

表1 采用VITEK 2 GN微生物鑒定系統分析菌株A8的生理生化特征

圖1 利用最大似然法構建菌株A8的系統進化樹

2.2 發酵條件優化

2.2.1 碳源的優化

不同種類碳源對菌株瓊膠酶活力的影響見圖2-A。由圖2-A可知，當培養基中單獨添加瓊膠、葡萄糖、半乳糖或蔗糖時，菌株A8所產瓊膠酶的活力會存在顯著差異，當瓊膠作為培養基的唯一碳源時，瓊膠酶的活力最高，為5.60 U/mL。在以瓊膠作為唯一碳源的培養基中分別加入葡萄糖和蔗糖時，瓊膠酶的活力比瓊膠單獨作碳源時降低，可能是因為當葡萄糖或蔗糖與瓊膠同時存在時會降低菌株對瓊膠的利用，從而抑制了瓊膠酶的分泌。當半乳糖與瓊膠同時存在時，瓊膠酶的活力比瓊膠作為唯一碳源時高，達到7.91 U/mL，這可能是添加半乳糖會有利于菌株A8的生長，因此選擇瓊膠和半乳糖作為培養基的碳源。本研究進一步優化了培養基中瓊膠和半乳糖的最佳質量濃度。首先研究當瓊膠作為唯一碳源時不同的碳源質量濃度對瓊膠酶活力的影響(圖2-B)。當瓊膠的質量濃度低于2 g/L時，瓊膠酶活力隨著瓊膠質量濃度的增加而提高，當瓊膠的質量濃度為2 g/L時酶的活力最高，這與吳國漢[18]的研究結果一致。當瓊膠的質量濃度繼續增加時，瓊膠酶活力反而下降，可能是因為瓊膠的質量濃度過高會限制培養基的流動性，使營養物質分布不均勻，同時影響通氣量，從而抑制菌株分泌瓊膠酶[19]。然后研究了在瓊膠質量濃度為2 g/L時不同質量濃度的半乳糖對瓊膠酶活力的影響(圖2-C)。半乳糖質量濃度為3 g/L時，菌株所產瓊膠酶的活力最高，達到8.10 U/mL，因此選擇2 g/L的瓊膠和2 g/L的半乳糖作為培養基的最適碳源質量濃度。

A-碳源種類；B-瓊膠質量濃度；C-半乳糖質量濃度；D-氮源種類；E-酵母浸粉質量濃度；F-NaCl質量濃度

2.2.2 氮源的優化

由圖2-D可知，菌株A8在生長繁殖過程中可以利用有機氮源或無機氮源，不同種類的氮源對瓊膠酶活力的影響差異顯著。當酵母浸粉作為培養基中唯一的氮源時瓊膠酶的活力最高。因此，選擇酵母浸粉作為菌株A8發酵產酶的最適氮源。進一步優化了培養基中酵母浸粉的最佳質量濃度。如圖2-E所示，瓊膠酶活力隨著酵母浸粉質量濃度的增加先上升后下降，在質量濃度為3 g/L時最大，達到8.88 U/mL。這與產瓊膠酶海洋菌株Agarivoranssp.FG15的最適氮源質量濃度一致[20]。因此，選擇3 g/L酵母浸粉作為菌株A8產酶培養基的氮源。

2.2.3 NaCl質量濃度的優化

海洋菌株的生長狀況與培養基的滲透壓有一定關系，而培養基滲透壓的大小主要取決于NaCl的質量濃度[21]。因此，可以通過調節培養基中NaCl的質量濃度從而使菌株處于最適的生長狀態。在人工海水的基礎上優化NaCl的質量濃度來確定用于菌株A8產酶培養基的最適滲透壓。圖2-F表明，當培養基中NaCl的質量濃度為5 g/L時培養基上清液中瓊膠酶的活力最高，為11.00 U/mL。當NaCl質量濃度>5 g/L時，瓊膠酶活力隨著NaCl質量濃度的增加而降低，這可能是因為過高的滲透壓抑制了細菌生長，從而影響菌株A8的產酶。因此，菌株A8產酶培養基的最適NaCl質量濃度為5 g/L。

2.2.4 接種量的優化

接種量對瓊膠酶活力的影響如圖3-A所示。接種量的改變對培養基中瓊膠酶的活力無顯著性影響，當接種量為2%時，瓊膠酶的活力最高，為10.80 U/mL。邵嫄等[22]同樣研究發現，當接種量為2%時，海洋菌株Vibriosp.NTi所產瓊膠酶的活力最高。因此，選擇2%作為菌株A8的最適接種量。

A-接種量；B-pH；C-溫度

2.2.5 培養基pH的優化

培養基pH對瓊膠酶活力影響很大，一方面會影響菌株生長，另一方面可能會使酶的活性位點在形成離子狀態時產生不可逆的鈍化或失活[23]。由圖3-B可知，pH為6.0時瓊膠酶活力最高，為12.35 U/mL。何宇等[24]研究發現,海洋菌株D3的最適初始pH為6.5，與菌株A8相似。本研究發現，pH低于6.0或高于7.0時，瓊膠酶活力均表現出明顯下降趨勢，可能是由于酸性和堿性環境抑制菌株產酶及瓊膠酶活力。

2.2.6 培養溫度的優化

溫度對瓊膠酶活力的影響如圖3-C所示，當培養基溫度在15～25 ℃之間時，瓊膠酶活力隨著溫度的升高而增加，瓊膠酶活力在25 ℃時最高。研究發現，產瓊膠酶海洋菌株Pseudoalteromonassp.CY24[25]、AgarivoransalbusYKW-34[26]的最適培養溫度與本實驗一致為25 ℃。高于25 ℃時，瓊膠酶活力隨著溫度增加而降低，可能是因為溫度過高抑制菌株的生長繁殖。因此，菌株A8的最適培養溫度為25 ℃。

2.2.7 正交試驗結果

單因素試驗結果表明瓊膠質量濃度、培養基初始pH、培養溫度3個因素對菌株A8產酶影響最大，選擇這3個因素做3因素3水平正交試驗，正交試驗設計如表2所示。產瓊膠酶培養基成分的正交試驗結果如表3所示。3個因素對菌株產酶的影響程度為A>B>C，即瓊膠質量濃度對菌株產酶的影響最大，其次是培養基初始pH，最后是培養溫度。最佳組合為A2B3C1，也就是瓊膠質量濃度為2 g/L、初始pH為7.0、培養溫度為20 ℃，在此條件下培養24 h后發酵液中瓊膠酶的活力達到21.80 U/mL。與已報道的瓊膠酶產生菌的酶活力[27-28]相比具有一定的優勢。

表2 產瓊膠酶培養基成分的正交試驗因素和水平表

表3 產瓊膠酶培養基成分的正交試驗結果

2.3 菌株生長對其產酶影響

最終確定菌株A8的最適產酶培養基為在人工海水中添加瓊脂2 g/L、半乳糖3 g/L、酵母浸粉3 g/L、NaCl 5 g/L；最適培養條件為溫度20℃、接種量2%、pH 7.0。進一步研究菌株A8生長與產酶之間的相關性。在最適培養條件下，菌株在最適產酶培養基中的生長與產酶曲線如圖4所示。

圖4 菌株A8的生長曲線及產酶曲線以及其Pearson相關性

菌株A8在6 h之后進入對數生長期，6～21 h內生物量迅速的增長，在21～30 h達到穩定期，并且發酵液中瓊膠酶的活力在24 h時達到最大值，之后菌株進入衰亡期，發酵液中瓊膠酶的活力逐漸下降。Pearson相關性分析顯示，菌株A8的生長與產酶具有顯著相關性(P<0.01)，表明生長狀況對菌株產酶具有重要影響。

2.4 瓊膠酶的分離純化

不同(NH4)2SO4飽和度下沉淀物中的蛋白含量與瓊膠酶總活力如圖5-A所示。結果顯示，隨著(NH4)2SO4飽和度的增加，沉淀物的蛋白含量與瓊膠酶總活力逐漸增加，當(NH4)2SO4飽和度為30%～80%時瓊膠酶的總活力較高。然而，當硫酸銨飽和度為70%～80%時，蛋白含量上升速度明顯超過瓊膠酶總活力的上升速度，推測此時析出的蛋白質大多為雜蛋白。因此在后續純化步驟中，采用飽和為30%～60%的(NH4)2SO4分級沉淀方法進行瓊膠酶的粗分離。進一步，采用DEAE陰離子交換層析對初分離的瓊膠酶進行純化。瓊膠酶的DEAE陰離子交換層析純化結果如圖5-B所示，使用0.3 mol/L NaCl溶液洗脫后得到了2個峰，分別對2個峰的瓊膠酶活力進行測定，結果顯示只有第2個峰具有瓊膠酶活力。

A-不同(NH4)2SO4飽和度下沉淀物中的蛋白含量于瓊膠酶活力關系；B-瓊膠酶的DEAE陰離子交換層析純化結果;C-瓊膠酶SDS-PAGE凝膠電泳結果泳道1-Marker;泳道2-(NH4)2SO4沉淀得到的酶液;泳道3-發酵液上清液;泳道4-離子交換層析得到的酶液

分別對菌株A8發酵培養基上清液、(NH4)2SO4沉淀、DEAE陰離子交換層析的總蛋白和總酶活力進行測定，然后計算出比活力、回收率及純化倍數，結果如表4所示。經(NH4)2SO4沉淀和DEAE陰離子交換層析純化后，瓊膠酶的比活力為141.52 U/mg，回收率為15.21%，純化倍數為3.26。進一步對純化后的瓊膠酶進行SDS-PAGE凝膠電泳驗證，結果如圖5-C所示。最初的發酵液上清中蛋白條帶較多，經過(NH4)2SO4沉淀和離子交換層析后得到單一條帶，分子質量約為37 kDa，推測為瓊膠酶。研究發現，不同種類微生物所產瓊膠酶的分子質量有一定的差別：從南極分離出的Pseudoalteromonassp.NJ21所產瓊膠酶分子質量為80 kDa[29]；自海洋沉積物中分離出的Acinetobactersp.PS12B所產瓊膠酶分子質量為24 kDa[13]。后續將進一步對分離的瓊膠酶的酶學性質和結構組成進行深入研究。

表4 瓊膠酶分離純化結果

3 結論

本實驗從龍須菜表面分離出1株產瓊膠酶的海洋細菌，初步鑒定為革蘭氏陰性菌。利用VITEK 2 GN生理生化鑒定和16S rRNA基因序列的系統進化樹分析，鑒定該菌為V.fluvialis，重新命名為VibriofluvialisA8。通過單因素試驗和正交試驗確定其最適產酶培養基為在人工海水中添加2 g/L瓊脂、3 g/L半乳糖、3 g/L酵母浸粉、5 g/L NaCl；最適培養條件為溫度20 ℃、接種量2%、pH 7.0。在上述條件下培養24 h，發酵液中的瓊膠酶活力達到21.80 U/mL，是優化之前的4.05倍。采用(NH4)2SO4分級沉淀和DEAE陰離子交換層析，得到了電泳純度較高的瓊膠酶，純化倍數為3.26，比活力為141.52 U/mg，回收率為15.21%。純化后的瓊膠酶經SDS-PAGE凝膠電泳檢測為單一條帶，分子質量為37 kDa。該菌株分泌的瓊膠酶經純化后有較高酶活力，可用于瓊膠寡糖的制備。